基于網絡藥理學探究銀杏葉提取物治療突發性耳聾的機制

黃 巧，尹時華，翟思佳，廖行偉，劉宇超

（廣西醫科大學第二附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，廣西 南寧530007）

突發性耳聾通常是單側的，其病因尚未明確，可能的原因包括感染（尤其是病毒）、自身免疫性疾病、循環系統疾病和神經系統疾病［1］。目前治療包括全身應用類固醇、鼓室內注射類固醇、口服抗病毒藥物、血管擴張劑、高壓氧治療和中醫治療等［2］。銀杏葉提取物主要成分為總黃酮及白果總內酯，具有擴張血管、增加血流量、清除氧自由基、抗炎等作用［3］。研究表明，口服銀杏葉提取物（EGb761） 能減輕水楊酸鈉誘導的豚鼠耳蝸血管中血流減少；腹腔注射EGb761 對順鉑誘導的大鼠耳毒性具有保護作用，如ABR 聽力閾值偏移、保護內耳蝸電位和毛細胞完整性；此外，EGb761 還顯著抑制噪音誘發的耳鳴［4］。目前銀杏葉提取物（金納多） 也被廣泛用于突發性耳聾的臨床治療，但其作用機制尚未明確。

網絡藥理學通過對生物學數據全面分析，構建藥物-疾病靶點網絡，從多層面揭示中藥活性成分與疾病的相互作用機制［5］。本研究采用網絡藥理學，分析銀杏葉提取物活性成分、靶點，探討其治療突發性耳聾的作用機制。

1 材料與方法

1.1 活性成分及靶點篩選 通過中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，http： ／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php） 檢索銀杏葉所有化學成分，根據口服利用度（OB） 和類藥性（Druglikeness，DL），篩選出OB≥30% 且DL≥0.18 的化學成分作為銀杏葉活性成分。經GeneCards 數據庫 （https： ／ ／www.genecards.org／） 篩選銀杏葉活性成分靶點基因及與突發性耳聾相關的基因，根據相關性分數 （Relevance score） ≥10 作為候選靶點基因。

1.2 網絡構建與功能分析 通過String 數據庫獲得疾病靶點PPI 數據，篩選得分≥0.4 的PPI 數據進行網絡構建［6］。應用Cytoscape3.7.1 軟件構建成分-靶點-疾病網絡。利用插件ClueGO 對銀杏葉提取物治療突發性耳聾的潛在靶點進行GO 分析和KEGG 通路分析。

2 結果

2.1 活性化合物篩選及成分-靶點-疾病網絡構建 經過篩選獲得27 種活性成分（表1）、307 個活性成分靶點和744 個疾病靶點。利用Uniprot 數據庫對靶點標準化，并去除重復靶點，最終獲得223 個活性成分靶點和744 個疾病靶點。將活性成分與其作用靶點導入Cytoscape3.7.1 軟件構建成分-靶點網絡圖（圖1），該網絡由235 個節點（12 種活性成分和223 個靶點），306 條邊組成。通過String 數據庫獲得疾病靶點PPI 數據，篩選得分≥0.4 的PPI 數據，并導入Cytoscape 構建疾病靶點網絡互作圖（圖2），該網絡由416 個節點和3 624 條邊組成。利用merge 功能將成分-靶點網絡圖與疾病靶點網絡互作圖合并，得到由627 個節點、3 930 條邊組成的成分-靶點-疾病網絡圖（圖3），其中包括12 個銀杏葉提取物活性化合物和24 個銀杏葉提取物治療突發性耳聾的預測靶點（表2）。

表1 27 種銀杏葉活性成分

圖1 銀杏葉活性成分-靶點網絡

圖2 突發性耳聾靶點網絡

圖3 成分-靶點-疾病網絡

2.2 功能分析 利用插件ClueGO 對24 個銀杏葉提取物治療突發性耳聾的預測靶點進行功能分析，獲得P＜0.05的37 條GO 分析結果、37 條KEGG 信號通路分析結果。GO 分析富集在細胞穩態，激活參與凋亡過程的半胱氨酸型內肽酶活性，自噬的負調控，脂肪酸氧化與代謝，激素分泌的負調節，調節單加氧酶、一氧化氮合酶與端粒酶活性，對單胺及兒茶酚胺的反應，調節淋巴細胞凋亡過程，不存在配體時外源性凋亡信號通路等生物過程（圖4）。KEGG 信號通路富集在卡波西肉瘤相關的皰疹病毒感染、細胞凋亡、甲狀腺激素信號通路、HIF-1 信號通路、AMPK 信號通路、T 細胞受體信號通路、TNF 信號通路、PPAR 信號通路、p53 信號通路、VEGF 信號通路、雌激素信號通路、催乳素信號通路、B 細胞受體信號通路等37條信號通路（圖5）。經查閱文獻，發現與耳聾相關的信號通路有脂肪酸降解［7］、HIF-1 信號通路［8］、p53 信號通路［9］、AMPK 信號通 路［10］、細胞凋 亡［11］、TNF 信號通路［12］、雌激素信號通路［13］、甲狀腺激素信號通路［14］、2型糖尿 病［15］、乙型肝炎［16］、結直腸 癌［17］、膠質瘤［18］、黑色素瘤［19］、慢性粒細胞白血病［20］、自身免疫性甲狀腺疾病［21］。

表2 銀杏葉提取物治療突發性耳聾的預測靶點

圖4 預測靶點的GO 分析

3 討論

圖5 預測靶點的KEGG 通路分析

突發性耳聾為原因不明的急性聽力損失，隨著研究不斷深入，迄今為止涉及的一些機制和途徑包括耳蝸血管閉塞、炎癥、氧化應激、鉀和鈣失調、線粒體功能障礙和細胞凋亡等［4，22］。銀杏葉提取物主要含總黃酮及白果總內酯，本研究通過網絡藥理學分析技術，發現銀杏葉提取物治療突發性耳聾的主要藥效成分有槲皮素、兒茶素、山柰酚、銀杏內酯、木犀草素-4′-葡萄糖苷、β-谷甾醇、油酸乙酯、亞麻酸乙酯、木犀草素等。順鉑對聽覺損害明顯，用于耳聾模型的制備［23］，有研究顯示，銀杏內酯B 通過上調miR214 減少p53 介導的NOX4／p66 （shc） 途徑，減少超氧化物的產生和細胞凋亡，從而達到對順鉑誘導的細胞毒性的保護作用［24］；山柰酚通過誘導HO-1 表達，增加細胞GSH 和GCLC 水平，從而抑制順鉑誘導的細胞凋亡［25］；槲皮素可以減輕慶大霉素誘導的大鼠耳毒性和組織病理學損傷，對順鉑誘導的斑馬魚細胞凋亡具有保護作用［26-27］，此外，槲皮素還具有降低抗氧化活性，保護耳蝸免受噪音誘發的聽力損失［28］。鼓室內給予兒茶素對輻射誘導大鼠的聽力損失具有保護作用，其能顯著降低c-Jun N 末端激酶（p-JNK）、細胞外信號調節激酶（p-ERK） 切割的半胱天冬酶-3 和PARP 的表達，阻止ROS 的產生抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs），這些結果表明兒茶素顯著抑制輻射誘導的聽覺毛細胞凋亡，并且兒茶素可能是預防輻射誘導的耳毒性的安全有效的候選治療［29］。亞麻酸乙酯可以增加ERK 和JNK 活性［30］，ERK 在內耳毛細胞中的功能是有爭議的。據報道在神經感覺上皮細胞中，抑制MAPK／ERK1／2顯著降低新霉素（8 h） 治療引起的內毛細胞死亡，表明ERK 的激活可能促進內耳毛細胞死亡；相反，一些研究報道ERK 的活性形式充當了生存因子，MEK1／2 的長期抑制（約48 h） 導致內耳毛細胞死亡，這表明內耳毛細胞中ERK 激活的基礎水平對其存活至關重要［31］。亞麻酸乙酯有可能通過增加ERK 活性從而抑制內耳毛細胞凋亡，達到治療突發性耳聾的目的，但其需進一步研究。β-谷甾醇具有抗炎作用［32］，研究表明免疫／炎癥反應可能是突發性耳聾的發病機制，β-谷甾醇可能通過控制炎性細胞因子的產生在一定程度上改善耳聾的程度。這進一步證實了篩選出的銀杏葉活性化合物可用于治療突發性耳聾預測的研究。

篩選出 的潛在 靶點有 KCNH2、BDNF、NOS3、ADIPOQ、CASP3 等。KCNH2 又稱HERG，它編碼介導心臟復極電流IKr的K+通道，MinK 與HERG 關聯能增加電流幅度。在內耳中，已經證明MinK 和KCNQ1 在血管紋的邊緣細胞中的表達，并且二者中任一蛋白的無效缺失都能消除耳蝸電位［33］。然而，HERG 在內耳K+通道中的作用尚不清楚，銀杏葉提取物是否能通過作用于它影響耳蝸電位，進而改善聽力有待研究。BDNF 表達于成人內耳的耳蝸毛細胞和支持細胞的頂端極中，BDNF 和神經營養因子受體是人類早期內耳發育過程中的重要參與者，對感覺神經元存活和胚胎內耳中感覺上皮細胞的神經元投射的建立至關重要［34］。小鼠耳蝸中的BDNF 缺失導致內毛細胞突觸的胞吐作用減少，并減少聲音誘導的聽覺腦干反應［35］。血管內皮是血管活性物質，如一氧化氮（NO） 的來源，其調節血管平滑肌張力和血流。最近的研究表明NO 也可能在耳蝸血流調節中起重要作用，NO 生物利用度的降低可能導致內皮功能障礙、耳蝸血液供應減少以及耳蝸的組織學和聽覺改變，低內皮型一氧化氮合酶（eNOS） 活性可能導致聽力損失［36］。Wu 等［37］通過測量736 名受試者中血漿脂聯素顯示，ADIPOQ基因型可能通過調節血漿脂聯素水平對聽力水平產生影響。HIF1A 是使細胞在缺氧條件下存活的關鍵轉錄因子，Chung 等［38］研究發現HIF1A 上調可以防止BALB／c 雜交小鼠噪聲誘導的聽力損失。db／db 小鼠伴有明顯的聽閾閾值升高和毛細胞丟失，Lin 等［8］研究發現，在db／db 小鼠耳蝸中HIF1A 水平表達顯著增加，信息調節子（sirtuin1，SIRT1） 過表達能顯著抑制高糖誘導的HIF1A 水平。細胞周期蛋白D1 抑制對于毛細胞的靜止很重要，同時維持細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達，支持細胞增殖活性的急劇下降與細胞周期蛋白D1 下調相平行，因此，細胞周期蛋白D1 對支持細胞的增殖可塑性起著關鍵作用，支持細胞中靶向細胞周期蛋白D1 誘導可能是內耳增殖再生的途徑［39］。CASP3 為細胞凋亡因子，慶大霉素與水楊酸鈉上調內耳毛細胞和螺旋神經節CASP3 表達，引起細胞凋亡［40-41］。經典Wnt 信號傳導是前庭毛細胞再生的有效調節劑，研究表明，在小鼠中Wnt 信號傳導效應物β-連環蛋白可以通過增加通過經典Wnt 途徑的信號來促進感覺毛細胞的再生［42-43］。慶大霉素注射誘導螺旋神經節凋亡可能受凋亡的Fas-FasL 信號通路控制，研究［44］發現，過量谷氨酸暴露和Fas-FasL 信號通路活性升高可誘導解離的螺旋神經節細胞凋亡。研究表明MAPK1／MAPK3 激活以及隨后的信號驅動外毛細胞死亡，MAPK1 信號傳導作為順鉑誘導的細胞凋亡和耳蝸毛細胞丟失的增強因子，siMAPK1 負載納米粒子治療可作為順鉑耳毒性副作用的治療策略［45］。目前越來越多的研究致力于PPARs，包括PPARα、PPARβ／δ和PPARγ，這些受體在脂質傳感器和多種代謝途徑中起著重要的生理作用，PPAR 通過上調抗氧化相關基因的轉錄和抑制ROS 的產生參與氧化還原平衡的調節［46］。PPARγ和PPARα 蛋白存在于聽覺毛細胞和小鼠耳蝸中的其他細胞類型中，PPAR 激動劑，如吡格列酮通過阻斷增加的ROS、脂質過氧化，增強細胞抗氧化防御，有效地防止慶大霉素對毛細胞的毒性，鼓室內注射吡格列酮可被認為是減輕噪音誘發的聽力損失和耳蝸損傷、減少炎癥信號和恢復耳蝸氧化還原平衡的有效治療策略［47］。以上靶點大多與炎癥、氧化應激、鉀和鈣失調、線粒體功能障礙和細胞凋亡有關，銀杏葉提取物治療突發性耳聾的機制可能是通過以上關鍵靶點發揮作用。

本研究通過功能分析發現，關鍵靶點參與細胞穩態、細胞凋亡、自噬的負調控、調節單加氧酶、一氧化氮合酶與端粒酶活性等生物過程；通路富集在細胞凋亡、AMPK信號通路、T 細胞受體信號通路、TNF 信號通路、PPAR 信號通路、p53 信號通路等。Wang 等［48］以過氧化氫誘導氧化應激為模型，發現銀杏葉提取物不僅能減弱過氧化氫誘導的氧化應激和促進小鼠離體耳蝸神經干細胞的活力，可以逆轉關鍵的內在凋亡途徑因子的變化，包括Bcl-2、Bax 和caspase-3，從而支持銀杏葉提取物在預防氧化應激相關聽力損失方面的潛在治療價值。

綜上所述，銀杏葉提取物中槲皮素、兒茶素、山柰酚、銀杏內酯、β-谷甾醇、亞麻酸乙酯等活性化合物可能靶向作用于KCNH2、BDNF、NOS3、ADIPOQ、CASP3 等多個靶點，參與細胞穩態、細胞凋亡、自噬的負調控等多個生物過程，并通過細胞凋亡、AMPK 信號通路、T 細胞受體信號通路、TNF 信號通路、PPAR 信號通路、p53 信號通路等多條信號通路調節內耳的鉀和鈣平衡、炎癥、氧化應激、線粒體功能和細胞凋亡，進而達到治療突發性耳聾的目的。然而，這需要更多的研究進一步證實。