基于網絡藥理學探討黃芪-丹參配伍在糖尿病腎病中的應用

王小龍，亓詠梅，席永寬

（安徽省阜陽市中醫醫院藥劑科，安徽 阜陽236000）

糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN） 是糖尿病常見的慢性并發癥之一，也是導致終末期腎病（ESRD） 的關鍵因素。我國住院糖尿病患者腎病的并發率達33.6%，約30% 1 型糖尿病和20%～50% 2 型糖尿病患者發生DN［1］。其中年齡、病程、高血糖、高血壓、血脂紊亂、高尿酸、吸煙、肥胖等是DN 的相關危險因素［2］。西醫對于早期DN的治療多針對患者血壓、血脂、血糖的控制來推遲腎病的出現，后期則以腹膜透析、腎移植為主。雖然臨床上取得了一定的療效，但由于不良反應大，患者依從性相對較差，一定程度上限制了其臨床應用。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceuus（Fisch.） Bge.var.mongholicus（Bge.） Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceuus（Fisch.） Bge.的干燥根。其味甘、性微溫，主含黃芪多糖、三萜類、黃酮類等化合物，能調節血糖、降血壓、降血脂［3］。《中國藥典》 言其主“內熱消渴”，一些研究［4-6］也證實了黃芪對于DN 的獨特療效。丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，已有研究［7］證實丹參提取物能有效降低早期DN 患者的炎癥反應，并改善腎血管內皮功能。黃芪與丹參相使配伍，益氣與活血并重，氣旺血行，血行氣亦旺，共奏益氣活血、推陳出新之功，有較好的協同作用，且兩藥一定比例的配伍優于單味作用［8-9］。黃芪-丹參配伍能通過改善DN 大鼠腎臟線粒體呼吸功能及能量代謝，改善DN 大鼠腎臟的功能，故常聯合用于治療DN，效果顯著［10-11］。本研究借助TCMISS 軟件及BATMAN-TCM 平臺，以DN 相關中藥處方為研究對象，從關聯規則Apriori 算法及網絡藥理學切入，探討黃芪-丹參組合在DN 中的應用規律、作用靶點及其作用機制。

1 資料與方法

1.1 處方來源 處方來源于張光榮主編的《糖尿病效驗秘方》［12］一書，該書收錄了DN 古今驗方92 首，其中同時出現黃芪-丹參組合的54 首，故將此54 首處方納入本次研究。《糖尿病效驗秘方》 由中國醫藥科技出版社出版，該書內容豐富、通俗易懂、療效確切、針對性強，具有一定的代表性。

1.2 數據預處理 數據預處理是數據挖掘中極為重要的一環，針對中藥方劑數據挖掘需要一套以數據清洗為主的數據預處理方法，使數據規范、準確和有序，利于后續的挖掘處理［13］。為便于統計、降低數據挖掘結果的偏差，本次研究參考高等院校《中藥學》［14］教科書，將藥名進行統一化處理。教材中未收錄的，參考《常用中藥別名速查手冊》 一書［15］，其余均使用統一的名稱，以確保數據的整齊性即可。

1.3 數據錄入 將納入研究的的92 首處方藥物由專人錄入“中醫傳承輔助平臺（TCMISS） V2.5” 軟件（由中國中醫科學院中藥研究所提供） 中的“平臺管理” →“方劑管理” 模塊，建立DN 的方劑數據庫。并將相關數據錄入BATMAN-TCM （Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of TCM，http： ／ ／bionet.ncpsb.org／batmantcm／） 平臺進行藥物-成分-疾病-靶點分析。考慮到人工錄入可能出現的偏差，完成數據錄入后，由另一名研究人員對數據進行逐條審核，以確保數據與原書相符。

1.4 數據提取 進入TCMISS 的“數據分析系統模塊”“方劑類別” 下拉框選擇“糖尿病腎病”，“指定中藥” 輸入“黃芪”，點擊“查詢” 按鈕，共搜索出符合條件記錄75 條。將“黃芪” 刪除，再輸入“丹參”，點擊“結果中查詢” 按鈕，則提取出含有黃芪-丹參藥組的54 首處方。

1.5 數據分析 采用TCMISS 軟件中的“數據分析系統”進行頻次統計、關聯規則Apriori 分析、組方規律分析。運用BATMAN-TCM 平臺進行藥物-成分-疾病-靶點分析。完成數據分析后，將數據導出，運用Microsoft Excel 表格對數據進行排序整理。

2 結果

2.1 用藥頻次分析 在 “數據提取” 的基礎上，點擊“頻次統計”，共出現104 味中藥。點擊“藥頻導出”，將每味中藥的出現頻次進行求和，共計607 味次。頻次由高到低的前五味為黃芪、丹參、茯苓、山藥、益母草，出現頻次均≥26 次。用藥頻次≥10 的見表1。藥物功效分類見圖1、表2。

表1 出現頻次≥10 的藥物

圖1 頻次≥2 的藥物一級功效分類

2.2 基于關聯規則Apriori 算法分析 點擊“組方規律” 按鈕，根據高頻藥物組合數量，通過將支持度個數設置為19，共出現30 條藥物組合模式，其中包含9 味中藥。見表3。

支持度個數為19 條件下，通過進一步將置信度設置為0.8，點擊“規則分析”，共出現包含6 味中藥的27 條關聯規則。通過進一步整理，將此27 條關聯規則展示如下，見表4。進一步進行藥物之間的網絡圖展示，見圖2。通過設置不同的支持度，顯示核心藥物與外圍藥物之間不同的配伍規則，見圖3～4。

表2 頻次≥2 的藥物二級功效分類

表3 支持度個數為15 條件下的高頻藥物組合模式

表4 Apriori 算法的藥物關聯規則分析

圖2 支持度個數19，置信度0.8 條件下藥物關系網絡圖

圖3 支持度個數10，置信度0.8 條件下藥物關系網絡圖

圖4 支持度個數6，置信度0.8 條件下藥物關系網絡圖

2.3 黃芪-丹參組合的網絡藥理學分析 將黃芪-丹參組合錄入BATMAN-TCM 平臺進行網絡藥理學分析，Score cutoff 調至30，Adjusted P_ value cutoff 調至0.05，共搜集到相關化合物192 個，其中83 個未發現化合物結構信息，故其余的109 個化合物可進行靶點、疾病、信號通路預測。信號通路、GO 功能、相關疾病的富集分析結果見表5～7。進一步將成分-靶點-信號通路-疾病進行網絡圖展示，見圖5。

表5 KEGG 信號通路分析

表6 GO 功能富集分析

表7 相關疾病富集分析

3 討論

3.1 黃芪-丹參配伍的高頻藥物分析 本次研究的54 首處方 中，除黃芪、丹參以 外，茯 苓 （57.41%）、山 藥（53.70%）、益母草（48.15%） 使用頻次亦較高，均在26味次以上。且高頻藥物功效主要集中在補虛、活血化瘀、清熱、利水滲濕、收澀等，頻次均≥42 次。通過進一步將高頻藥物進行二級功效分類，發現高頻藥物以補氣、活血調經、利水消腫、清熱涼血、補血、補陰、固精縮尿止帶藥為主。其中補氣藥與活血調經藥顯著高于其他藥物，與黃芪-丹參的配伍功效相符。

圖5 化合物-靶點-信號通路-疾病網絡圖

3.2 黃芪-丹參配伍的高頻藥物關聯規則分析 支持度個數是指藥物組合在所選處方中出現的頻次；置信度表示當A 藥出現時，B 藥出現的概率，其關系用符號“-＞” 表示。支持度個數與置信度均可根據實際情況進行調節［16］。本次研究根據高頻藥物組合的數量，首先將支持度設置為19，出現了30 條藥物組合模式，其中包含了9 味中藥。進一步限制置信度為0.8，出現了6 味節點中藥，以黃芪-丹參為核心組成了27 條關聯規則，均體現了圍繞脾、腎兩臟的補氣、滋陰、化瘀為主的糖尿病腎病［17］治療法則。通過調整不同的支持度個數，可以從網絡圖中直觀地看出以黃芪-丹參為核心的外圍藥物組合模式。支持度個數較低時，基本能反映出圍繞黃芪-丹參的核心組合；隨著支持度個數的升高，藥物數量增加，可以較全面的顯示出藥物組合的臨床使用情況［18］。當支持度個數為19 時，出現了圍繞黃芪-丹參組合的山藥、川芎、茯苓、益母草、生地黃、當歸、山茱萸7 個外圍中藥。支持度個數調整為10 時，則增加了熟地黃、水蛭、蒼術等外圍藥物。進一步降低支持度個數，則較為全面地反映出以黃芪-丹參為核心的藥物組合模式，體現了以補氣健脾、滋陰生津、利水滲濕、活血化瘀的治則治法，反證了DN 脾氣虛弱、脾腎兩虛，陰虛燥熱、本虛標實的病因病機［19］。

3.3 黃芪-丹參組合的網絡藥理學分析本次研究的黃芪-丹參配伍組合中，共有109 個化合物，進一步分析顯示有29 條KEGG 信號通路及60 條GO 功能顯著富集。而嘌呤代謝、鈣信號途徑、腎素-血管緊張素系統、炎癥免疫介質、以及線粒體凋亡途徑等均參與了DN 的發病［20-22］。腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS） 是一種與血管密切相關的內分泌系統，在糖尿病腎病發病機制有著極其重要的作用，局部AngⅡ的增多可以通過增加腎小球出球小動脈的壓力，并抑制足突細胞去氧腎上腺素的表達，加上糖尿病患者的高血糖狀態晚期糖基化終末產物（AGEs） 的形成和排泄增多，導致尿蛋白的超濾過，進而加重足細胞的損傷，并進一步激活RAAS，造成惡性循環，從而引起持續性蛋白尿、腎小球硬化及進行性腎功能惡化［23-25］。此外，線粒體功能紊亂可引起慢性微炎癥狀態、基質降解及血管內皮的纖維化，而發生機制均有Ca2+通道的異常調控的參與，其機制可能為Ca2+通過激活一氧化氮合酶活性，上調一氧化氮水平，抑制呼吸鏈中復合體Ⅳ活性，增加活性氧類含有量，而活性氧類大量積聚以及細胞鈣調節紊亂的出現，加劇細胞壞死，導致機體損傷與修復并行，加重DN 血管病變［26-28］。另一方面，在DN 的發生發展中，TNF-α、MCP-1、IL-6、ICAM-1 等炎性細胞因子也起著重要作用，炎癥因子表達增多可促進炎性巨噬細胞的浸潤，最終導致腎小球基膜產生增多，加速腎小球硬化進程，從而加快DN 的病情進展［29-30］。“邪氣盛則實，精氣奪則虛《素問·通評虛實論》”，RAAS 系統、線粒體功能紊亂，以及致炎因子表達的增多等均密切參與了DN 患者“本虛” “邪實” 的病理進程，反映了DN 多途徑、多環節、虛實相兼的發病特點。基于DN “陰虛燥熱，本虛標實” 的病因病機，黃芪-丹參一補一瀉相使為伍，其極有可能通過調節鈣信號途徑進而影響線粒體凋亡，同時影響腎素-血管緊張素系統、以及炎癥免疫介質的表達而發揮氣血同治、補瀉兼施的治療特色。TTD／OMIM 中靶點≥2 的相關疾病富集分析結果顯示，如高血壓病、神經癥、腎臟疾病、肥胖、缺血性腦中風等，這些大多是糖尿病或DN 的常見并發癥或伴隨癥狀，而以黃芪-丹參配伍的組合或可成為這些疾病的潛在治療藥物，值得進一步深入研究。

綜上所述，本次研究搜集了54 首含有黃芪-丹參組合治療DN 的處方，借助TCMISS 的關聯規則Apriori 算法，得出黃芪、丹參、茯苓、山藥、益母草為治療DN 的高頻藥物。通過設置不同的支持度個數，進一步挖掘出由少至多、由核心到外圍的黃芪-丹參相關組合模式。這些組合基本反映了DN 的病因病機和治則治法。進一步借助網絡藥理學研究方法，從微觀層面探討了黃芪-丹參組合治療DN的作用靶點和作用機制。然而由于本次研究的樣本量相對較少，難以較全面體現該病的治療用藥規律，有待于進一步的臨床及實驗驗證。