北沙參多糖分離純化及經(jīng)腸道菌群降解對體外免疫細(xì)胞增殖的影響

于欽輝，杜寶香，杜以晴，楊 佳，馬青云，文 冉，容 蓉

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南250355）

北沙參為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralisFr.Schmidtex Miq 的干燥根，是臨床上常用中藥。本品性甘、微苦、性微寒，歸肺、胃經(jīng)。有益胃生津、養(yǎng)陰清肺之功效，臨床上主要用于肺熱燥咳、勞嗽痰血、胃陰不足、熱病津傷、咽干口渴等癥［1］。研究表明北沙參所含的主要成分有香豆素、木脂素、聚炔類、多糖類等［2］。其中多糖類成分含有量最高有調(diào)節(jié)或增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，治療陰虛證的作用［3］。目前對北沙參多糖的研究更多的偏向于提取工藝優(yōu)化及理化性質(zhì)等方面［4-5］，對其免疫活性的研究較少。課題組報道過純化后的北沙參多糖對脾淋巴細(xì)胞的增殖活性的影響［6］，但尚未見關(guān)于純化后的北沙參多糖經(jīng)腸道菌群降解后對免疫細(xì)胞增殖活性影響的相關(guān)報道。

大多數(shù)中藥多糖在疾病治療方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但大分子碳水化合物在人體內(nèi)很難被直接吸收。腸道微生物群在人類消化生理及大腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)有著很重要的作用［7］。腸道中某些類型微生物可以多糖為能量來源，將其分解為易利用的小分子物質(zhì)，從而使多糖更好地發(fā)揮提高機(jī)體免疫力的作用［8］。大量研究結(jié)果顯示，北沙參化學(xué)成分眾多，其中多糖被認(rèn)為是北沙參重要的有效成分之一［3-6］。然而目前對北沙參單糖組成等初步結(jié)構(gòu)表征研究較少，并且由于多糖本身不易被機(jī)體吸收，故其作用機(jī)制始終未能明確。本研究對獲得的2 種多糖組分進(jìn)行單糖組成分析，并通過小鼠腸道菌群在體外對多糖成分進(jìn)行降解，測定2 種單糖降解前后對細(xì)胞增殖活性的影響，以期為腸道菌群在中藥代謝中的作用提供依據(jù)。本研究旨對分離純化得到的北沙參多糖，通過腸道菌群體外降解，觀察其對小鼠巨噬細(xì)胞、脾臟細(xì)胞增殖活性的影響，探討腸道菌群對體內(nèi)多糖的降解作用及增效機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器 UV-2550 型紫外分光光度計（日本島津儀器有限公司）；安捷倫6890 N 型氣相色譜儀、安捷倫1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Mettler AE240 電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒公司）；高速離心機(jī)TD5A（鹽城凱特實驗儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑 北沙參藥材購于山東省中醫(yī)院（批號170501），經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralisFr.Schmidtex M iq 的干燥根。對照品D-無水葡萄糖（批號MUST-14072601，純度＞98%）、D-（+） -木糖（批號MUST-16041913，純度＞98%），均購自成都曼斯特生物科技有限公司；對照品L-巖藻糖，L-鼠李糖（批號SA0411GA13，純度＞98%），D-阿拉伯糖（批號AJ0702FA14，純度＞98%），D-甘露糖（批號AA0416LA13，純度＞98%），D-半乳糖 （批 號YM0506YA14，純 度＞98%），均購自上海源葉生物科技有限公司；DEAE-52 纖維素（批號20170622，北京索萊寶科技有限公司）；牛血清白蛋白（批號130102，上海伯奧生物科技有限公司）；考馬斯亮藍(lán)G-250 （批號20130102，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；厭氧培養(yǎng)基（批號20180410，山東拓普生物工程有限公司）；濃硫酸（批號20160508，萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠）；苯酚、無水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、氯化鈉、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 動物與細(xì)胞株 BALB／c 雄性小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司RAW264.7 細(xì)胞，購自上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。本研究涉及的動物實驗經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號2016-007。

2 方法

2.1 北沙參粗多糖制備 稱取北沙參藥材2.0 kg，粉碎，過4 號篩，加入6 倍體積80% 乙醇，加熱回流提取2 次，每次2 h，抽濾，提取液另器存放；藥渣自然晾干至無醇味，加入10 倍量水于94.9 ℃浸提2 次［9］，每次120 min，2 次提取液合并，離心取上清液，上清液濃縮后加入4 倍量無水乙醇于4 ℃冰箱靜置過夜，過濾取沉淀，沉淀冷凍干燥后得北沙參粗多糖，在干燥器中放置保存。

2.2 北沙參多糖分離純化 采用DEAE-52 纖維素對北沙參粗多糖進(jìn)行分離。取“2.1” 項下北沙參粗多糖適量，蒸餾水溶解，分別以蒸餾水、0.05、0.1、0.3 mol／L NaCl溶液梯度洗脫，等體積收集流分，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，合并同一洗脫峰流分，冷凍干燥，分別制得蒸餾水、0.05、0.1、0.3 mol／L NaCl 溶液洗脫組分（D1、D2、D3、D4）。取得率較高的流分D1、D2 做后續(xù)分析［10］。

2.3 蛋白質(zhì)含有量測定 以0.100 6 mg／mL 的牛血清蛋白溶液為對對照品溶液，分別量取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于具塞刻度管中，加去離子水補(bǔ)足至1 mL，分別向每只試管中加入3 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液，混勻后室溫放置20 min，以蒸餾水為空白，在紫外585 nm 處測定其吸光度［11］。

樣品液制備，精密稱取“2.2” 項下D1、D2 組分適量，配成質(zhì)量濃度約為10.0 mg／mL 的供試品溶液，后續(xù)操作同對照品的處理方法。

2.4 總糖含有量測定 以0.145 8 g／L 的葡萄糖溶液為對照品溶液，分別量取對照品溶液0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 于試管中，加去離子水補(bǔ)足至總體積2 mL，每個濃度重復(fù)3 個樣品，分別向每只試管中加入5%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，迅速混合均勻。沸水浴中反應(yīng)30 min，以蒸餾 水為空 白，在490 nm 波長下進(jìn)行掃描［11-12］。

樣品液制備，精密稱取“2.2” 項下D1、D2 組分適量，配置成0.145 8 g／L 的多糖溶液，取0.7 mL，加去離子水補(bǔ)足至2 mL，后續(xù)操作同對照品的處理方法。

2.5 北沙參多糖單糖組成分析

2.5.1 北沙參多糖組分完全酸水解 精密稱取D1、D2 組分10.00 mg 于10 mL 具塞試管中，加入2 mol／L 三氟乙酸（TFA） 適量溶解多糖組分，置于100 ℃烘箱中水解10 h，40 ℃氮氣吹干，甲醇洗滌，吹干，重復(fù)此操作3～4 次，至TFA 蒸發(fā)完全。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物制備 分別稱取L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-無水葡萄糖、巖藻糖、D-半乳糖、D-木糖各5 mg，分別加入鹽酸羥胺5 mg，吡啶0.55 mL，肌醇六乙酸酯4 mg，混合均勻，于90 ℃水浴中反應(yīng)30 min。取出，待溫度降至室溫，加入0.55 mL 乙酸酐，90 ℃水浴反應(yīng)30 min 使乙酰化反應(yīng)完全。75 ℃氮氣吹干，氯仿溶解，過0.22 μm 濾膜于液相小瓶中，備用。取各對照單糖衍生物100 μL，混合均勻，得混合對照單糖衍生物，供GC分析用［13］。

2.5.3 水解多糖衍生物制備 取“2.5.1” 項下水解多糖樣品適量，按“2.5.2” 項下方法進(jìn)行衍生化處理，氯仿溶解，過0.22 μm 微孔濾膜于液相小瓶中，備用。

2.5.4 色譜條件 HP-5 毛細(xì)管柱 （320 μm× 30 m，0.25 μm）；FID 檢測器；升溫程序為初始溫度170 ℃保持3 min，以2 ℃／min 速率升至230 ℃，保持5 min；載氣N2；進(jìn)樣器溫度250 ℃；檢測器溫度300 ℃；氮氣體積流量1.2 mL／min，氫氣體積流量30 mL／min，空氣體積流量300 mL／min；進(jìn)樣量1.0 μL；進(jìn)樣方式分流進(jìn)樣；分流比60 ∶1。

2.6 多糖在腸道菌群中的體外降解［14-15］

2.6.1 厭氧培養(yǎng)液制備 稱取厭氧培養(yǎng)基9.5 g 于1 L 蒸餾水，加熱煮沸2 min 使徹底溶解，分裝，120 ℃高壓滅菌15 min，備用。

2.6.2 小鼠腸道菌群培養(yǎng)液制備 取小鼠新鮮糞便適量粉碎后置于100 mL EP 管中，按1 g ∶ 30 mL 的比例加入?yún)捬跖囵B(yǎng)液，充分渦旋，離心（1 000 r／min） 10 min，取上清。將上清液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿30 mL，37 ℃氣浴震蕩培養(yǎng)24 h，即得。

2.6.3 小鼠腸道菌群對北沙參多糖的降解 分別向“2.6.2” 項下培 養(yǎng)皿中加入 D1、D2 多糖水溶液（5 mg／mL）5 mL，混勻，繼續(xù)37 ℃氣浴震蕩12 h。同時設(shè)置空白對照組，即以等體積的蒸餾水代替多糖溶液。分別收集不同皿內(nèi)的培養(yǎng)液，離心（8 000 r／min） 10 min 取上清液，上清液用500 Da 的超濾膜進(jìn)行超濾，以去除培養(yǎng)液成分對后期實驗的干擾。取膜內(nèi)溶液，冷凍干燥后得到北沙參多糖降解產(chǎn)物。

2.6.4 降解產(chǎn)物分析 Agilent PL aquagel-OH MIXED-M 凝膠柱（7.5 mm × 300 mm，8 μm）；流動相去離子水；進(jìn)樣量10 μL；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；RID 檢測器溫度40 ℃。已知分子量對照品多糖為Dextran T 系列對照品品，分子量分別為5、10、12、50、100 kDa，以其分子量對數(shù)值與其相應(yīng)保留時間作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將降解前后的色譜圖進(jìn)行對比并對多糖降解結(jié)果進(jìn)行分析。取降解前后的北沙參多糖樣品適量，蒸餾水溶解，過0.45 μm 微孔濾膜，備用。

2.7 多糖及其降解產(chǎn)物對脾淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞增殖活性研究［16-17］

2.7.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞制備 取清潔級BALB／c 雄性小鼠，脫頸椎處死，70%酒精浸泡5 min，于超凈工作臺內(nèi)用手術(shù)剪剖開小鼠腹部，取出脾臟，用注射器吸取PBS 緩沖液沖洗脾臟中血液，以除去紅細(xì)胞。沖洗干凈后脾臟經(jīng)200 目篩網(wǎng)研磨，收集研磨液置于1.5 mL 離心管中，離心（1 000 r／min，10 min），棄 上清，用RPMI-1640 培養(yǎng)液（加10%血清和1%雙抗） 重懸細(xì)胞制得。

2.7.3 MTT 法測定細(xì)胞增殖 取RAW264.7 細(xì)胞稀釋至1×105／mL，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每 孔100 μL，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)12 h 后，加入不同濃度的多糖溶液（15.6、31.2、62.5、125、250、500 μg／mL） 100 μL，繼續(xù)孵育24 h。對于脾淋巴細(xì)胞，按 “2.7.1” 項下方法制得后，稀釋細(xì)胞濃度至1 × 106／mL，接種于96 孔培養(yǎng)板中，直接加入上述不同濃度的多糖溶液100 μL，培養(yǎng)44 h。各實驗組同時設(shè)置空白對照組，即不加藥液加入等體積的培養(yǎng)基。各細(xì)胞加藥培養(yǎng)相同時間后，每孔加入10 μL MTT，培 養(yǎng)4 h 后，棄上清，每孔加 入100 μL DMSO 溶 液，37 ℃震 蕩10 min 后，于酶標(biāo) 儀490 nm 處測定各孔OD 值，實驗重復(fù)3 次后取平均值進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 北沙參多糖分離純化 北沙參多糖經(jīng)DEAE-52 纖維素柱層析分離得到4 個北沙參多糖組分D1、D2、D3、D4。其中D3、D4 組分得率較低，故僅對D1、D2 組分進(jìn)行后續(xù)實驗分析。

3.2 蛋白質(zhì)含有量測定 以牛血清白蛋白對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y），得線性回歸方程Y＝7.475 1X+0.864 （R2＝1）。根據(jù)方程計算北沙參多糖D1、D2 組分中蛋白含有量分別為0.03%、0.14%。

3.3 總糖含有量測定 以葡萄糖對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo) （Y），得線性回歸方程Y＝15.592 0X-0.038 4 （R2＝0.999 1），根據(jù)方程計算北沙參多糖D1、D2 組分中總糖含有量分別為72.99%、80.04%。

3.4 單糖組成分析 混合對照品單糖及D1、D2 組分GC色譜圖譜圖見圖1，記錄各色譜峰的保留時間。測得各單糖的摩爾比，結(jié)果見表1。

3.5 多糖的腸道菌群降解產(chǎn)物分析 分離純化后的多糖D1、D2 分別被小鼠腸道菌群降解，得到降解產(chǎn)物DD1、DD2。本實驗采用凝膠滲透色譜對腸道菌群降解前后的北沙參多糖進(jìn)行分析。見圖2，可知DD1、DD2 的保留時間較之于D1、D2 明顯增加，表明北沙參多糖在腸道菌群作用下降解為分子量較小的多糖。

3.6 北沙參多糖及其腸道菌群降解產(chǎn)物對臟細(xì)胞及巨噬細(xì)胞增殖作用的影響

3.6.1 對脾淋巴細(xì)胞增殖作用 由圖3 可知，與空白對照組比較，D1、DD1 均能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，且在實驗濃度下，呈現(xiàn)鐘罩型量-效關(guān)系，在質(zhì)量濃度62.5 μg／mL時增殖活性達(dá)到最大。圖中顯示，在質(zhì)量濃度15.6、250 μg／mL 時D1 的增殖活性強(qiáng)于DD1，其他質(zhì)量濃度下，DD1 的增殖活性明顯強(qiáng)于D1 組分。

圖1 各成分GC 色譜圖

表1 各多糖單糖組成

圖2 各多糖降解前后HPLC 色譜圖

圖3 D1 及其降解產(chǎn)物對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

由圖4 可知，與空白對照組相比，D2、DD2 均能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，D2 的增殖活性在質(zhì)量濃度125 μg／mL 時達(dá)到最大，DD2 的增殖 活性在 質(zhì)量濃 度250 μg／mL 時達(dá)到最大。圖中顯示，在質(zhì)量濃度250 μg／mL 時DD1 的增殖活性強(qiáng)于D1，其他質(zhì)量濃度下，2 組分的增殖活性差別不明顯。

圖4 D2 及其降解產(chǎn)物DD2 對脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

3.6.2 對巨噬細(xì)胞增殖作用比較 由圖5 可知，與空白對照組比較，D1、DD1 均能提高小鼠巨噬細(xì)胞的增殖。在質(zhì)量濃度31.2、125 μg／mL 時D1 和DD1 的增殖活性分別達(dá)到最大。圖中顯示，在質(zhì)量濃度小于62.5 μg／mL 時D1 的增殖活性強(qiáng)于DD1，在質(zhì)量濃度大于62.5 μg／mL 時DD1的增殖活性強(qiáng)于D1。

圖5 D1 及其降解產(chǎn)物DD1 對小鼠巨噬細(xì)胞增殖活性的影響

由圖6 可知，與空白對照組比較，D2、DD2 均能提高小鼠巨噬細(xì)胞的增殖，且在實驗濃度下，呈現(xiàn)鐘罩型量-效關(guān)系。在質(zhì)量濃度62.5 μg／mL 時增殖活性達(dá)到最大。圖中顯示，DD2 的增殖活性明顯強(qiáng)于DD1。

4 討論

圖6 D2 及其降解產(chǎn)物DD2 對小鼠巨噬細(xì)胞增殖活性的影響

目前，常用的單糖測定色譜方法主要包括HPLC 法、離子色譜法、氣相色譜法和高效毛細(xì)管色譜法［18］，其中HPLC 法靈敏度較低［19］，離子色譜法雖然靈敏度較高，但糖類在電極表面能將某些分子氧化或還原，并且易受環(huán)境溫度的影響，進(jìn)而對結(jié)果產(chǎn)生影響［20］。氣相色譜法具有測定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、適應(yīng)性強(qiáng)等特點，因此本實驗中多糖采用三氟乙酸進(jìn)行水解并進(jìn)行GC 分析，區(qū)別于課題組之前的HPLC 分析。

北沙參成分復(fù)雜，研究表明北沙參有諸多的藥理活性［21］。多糖在北沙參中含有量較多，具有增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用［22］。課題組之前在北沙參多糖提取工藝優(yōu)化［9］、結(jié)構(gòu)表征［23］及純化后多糖的體外活性免疫研究［6］等方面做過詳細(xì)報道。據(jù)報道，目前市場上含多糖的中成藥制劑品種中口服制劑約占總品種的74.00%［24］。但是多糖在人體內(nèi)很難被直接吸收，其在人體內(nèi)的吸收代謝過程及作用機(jī)制尚不明確。胃腸道是口服藥物的必經(jīng)通道，其中大腸內(nèi)豐富的腸道菌群，在藥物的降解過程中起著重要的作用［25］。腸道菌群通過還原、脫羥、脫糖、脫甲基、乙酰化、脫羧等代謝反應(yīng)，轉(zhuǎn)化多種異物，可能形成新的活性物質(zhì)，進(jìn)而提高藥效。本研究首次將分離純化的北沙參多糖與腸道菌群降解相結(jié)合，探討多糖在經(jīng)腸道菌群降解后對細(xì)胞增殖活性的影響。

本研究尚存在若干不足之處，北沙參多糖降解產(chǎn)物的單糖組成與分子量范圍，以及體內(nèi)腸道菌群降解過程與降解產(chǎn)物的藥效作用機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。