當(dāng)歸-白芍藥對HPLC 指紋圖譜建立

閆宏麗 馬旭彤 鄧秀平宋 紋苗淑杰劉志東?

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津301617； 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津301617； 3.天津同仁堂集團股份有限公司，天津300385； 4.天津宏仁堂藥業(yè)有限公司，天津300122）

藥對又稱對藥，最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》 中的半夏秫米湯治療胃不和則臥不安癥［1］，是2 味中藥固定的配伍形式，把中藥和方劑巧妙的聯(lián)系在一起［2］。藥對配伍的主要依據(jù)是中醫(yī)基礎(chǔ)理論，即四氣五味、升降沉浮、歸經(jīng)及有毒無毒［3］。藥對的組成雖簡單，但可較全面的兼顧病情，最大限度發(fā)揮治療作用，體現(xiàn)適證化裁、靈活加減的優(yōu)點［4］。

當(dāng)歸-白芍為臨床常用的養(yǎng)血理血藥對，來源于《金匱要略》 之“當(dāng)歸芍藥散”［5］。且多與其他藥物配伍成別方應(yīng)用于臨床，如《四物湯》 《逍遙散》 《溫經(jīng)湯》 《大秦艽湯》 《當(dāng)歸芍藥散》 等。當(dāng)歸釋名干歸、山蘄、白蘄、文無，為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.） Diels 的干燥根，歸心、肝、脾經(jīng)，具有補血活血、調(diào)經(jīng)止血、潤腸通便的功效。白芍來源為毛莨科植物芍藥Paeonia lactifloraPall 的干燥根，性微寒，味苦、酸。歸肝經(jīng)、脾經(jīng)，具有補血斂陰、平肝止痛的功效［6］。辛香之當(dāng)歸（血中氣藥）與白芍陰柔補血之品（血中血藥） 相配使用，二者相須相使［7］，補血不滯血、溫而不燥，可用于補血調(diào)血。在現(xiàn)代藥理研究表明，當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯、阿魏酸等可抑制血小板聚集，增強巨噬細(xì)胞的吞噬功能，延長血栓的形成，具有抗血栓、提高機體免疫力的作用［8-10］；白芍中白芍總苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、抗氧化的作用［11-12］，沒食子酸等可起到抑菌殺菌的作用［13-15］。因此，當(dāng)歸-白芍藥對配伍使用，可起到很好的養(yǎng)血調(diào)肝、健脾利濕功效［16-17］。

當(dāng)藥物的物質(zhì)基礎(chǔ)不明確時，指紋圖譜可全面地反映復(fù)方中所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量。不同產(chǎn)地的當(dāng)歸、白芍其活性成分含有量有差別，單味當(dāng)歸、白芍及含當(dāng)歸、白芍中藥復(fù)方的指紋圖譜已有報道［18-21］，但關(guān)于當(dāng)歸-白芍配伍藥對的指紋圖譜研究尚未見報道。本實驗建立當(dāng)歸-白芍藥對HPLC 指紋圖譜，以期為中藥配伍規(guī)律研究、臨床用藥以及中成藥研制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（配置G1314B VWD 檢測器，美國安捷倫公司）；JA2103N 天平（千分之一，上海民僑精密科學(xué)儀器有限公司）；FA124 天平（萬分之一，天津億諾科學(xué)儀器有限公司）；KQ-400B 高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；ZDHW 調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；FDU-1200 真空冷凍干燥機（上海愛朗 儀器有 限公司）；去離子水機 （美 國Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 對照品沒食子酸（批號10831-201605，純 度 90.80%）、芍藥苷 （批 號 110736-201842，純 度97.40%）、阿魏酸（批號110773-201614，純度99.00%），均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品芍藥內(nèi)酯苷（批號Y21A9H59553，純度91.40%）、苯甲酰芍藥苷 （批號P21A9S68357，純度98.00%） 均購自上海源葉生物科技有限公司。甲醇（分析純，天津市康科德科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；磷酸（色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司）；去離子水由Milli-Q 超純水系統(tǒng)過濾得到。

不同產(chǎn)地當(dāng)歸、白芍藥材，經(jīng)天津宏仁堂藥業(yè)有限公司宋紋高級工程師和天津同仁堂集團股份有限公司苗淑杰教授級工程師鑒定為正品，信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酰芍藥苷對照品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制得各對照品質(zhì)量濃度分別為68.3、52.8、41.2、54.6、53.5 μg／mL 的混合對照品溶液，4 ℃保存，備用。

2.2 煎液制備 當(dāng)歸-白芍合煎液，精密稱取當(dāng)歸、白芍各10 g，混合，置500 mL 圓底燒瓶內(nèi)，加8 倍量去離子水，浸泡30 min，用調(diào)溫電熱套以220 V 加熱至沸騰后調(diào)至75 V 保持微沸，回流提取1 h，兩層紗布濾過；藥渣用8 倍量的去離子水再次回流提取1 h，兩層紗布過濾，合并2 次提取液，減壓濃縮至稠膏狀，置于-45 ℃冷旋預(yù)凍4 h后，置于-80 ℃的冷凍干燥儀中干燥24 h，得淺黃褐色當(dāng)歸-白芍干膏粉（無明顯氣味，易吸潮），出膏率（23.45±2.53）%，待用。

稱取制得的各個產(chǎn)地干膏粉0.15 g，于50 mL 三角瓶中，精密移取60%甲醇10 mL，搖勻，分別超聲（400 W、50 kHz） 處理30 min，取出室溫冷卻后，60% 甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，室溫靜置30 min，取上清液，過0.22 μm有機微孔濾膜，即得。分別吸取10 μL 進(jìn)液相色譜儀。

2.3 色譜條件 Waters X Bridge Shield RP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -0.1% 磷酸水（B），梯度洗 脫 （0 min，5% A；10 min，22% A；25 min，32%A；30 min，75% A；33 min，5% A；40 min，5%A）；體積流量0.8 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長230 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取當(dāng)歸-白芍藥對，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得各共峰相對保留時間RSD 0.03%～0.29%，各共有峰相對峰面積RSD 0.41%～1.15%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取當(dāng)歸-白芍藥對，按“2.2” 項下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.3” 項色譜條件下，分別進(jìn)行測定，測得各共有峰相對保留時間RSD 為0.02%～0.16%，各共有峰相對峰面積RSD 為0.33%～4.19%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取當(dāng)歸-白芍藥對，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下，分別于0、6、12、24、36、48、72 h 依次進(jìn)樣，測得各共有峰相對保留時間RSD 0.55%～0.87%，各共有峰相對峰面積RSD 0.79%～4.95%，表明供試品溶液在72 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜建立及評價

2.5.1 不同產(chǎn)地當(dāng)歸-白芍藥對指紋圖譜 根據(jù)各色譜峰的相對保留時間，確定了16 個共有峰并指認(rèn)出5 個特征峰，分別為沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酰芍藥苷。建立了當(dāng)歸-白芍藥對的對照指紋圖譜，見圖1；按“2.2” 項下方法分別制備18 批供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下依次進(jìn)樣，相似度見表2；HPLC 指紋圖譜見圖2。表2 顯示，不同產(chǎn)地18 批當(dāng)歸-白芍藥對相似度較高，大于0.99，故不同產(chǎn)地18 批當(dāng)歸-白芍藥對整體化學(xué)組分相似，制備工藝穩(wěn)定，但化學(xué)成分的含有量可能存在差異。

表2 18 批樣品相似度

圖1 當(dāng)歸-白芍樣品對照指紋色譜圖

圖2 不同產(chǎn)地18 批樣品HPLC 指紋圖譜

圖3 不同產(chǎn)地18 批樣品聚類分析圖

2.5.2 聚類分析 使用Metabo Analyst，對18 批樣品中16個共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行聚類分析，見圖3。18 批樣品可被分為2 大類，S4、S7、S8、S9、S10 為一類，其余為一類。即甘肅岷縣的當(dāng)歸和山東的白芍為一類，其余為一類。由此表明，甘肅岷縣的當(dāng)歸和山東荷澤的白芍該組合的指標(biāo)成分質(zhì)量相近，與其他產(chǎn)地的當(dāng)歸-白芍可明顯劃分，故認(rèn)為不同產(chǎn)地的藥材之間可能由于種植的土壤、溫度、光照和水分等不同而產(chǎn)生差異。

3 討論

3.1 色譜條件 當(dāng)歸-白芍藥對多以湯劑用于臨床，為保證與傳統(tǒng)煎劑盡可能相符，且活性成分極性較大，故以去離子水作為提取溶劑。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研及經(jīng)方中當(dāng)歸-白芍藥對的用藥比例，確定當(dāng)歸-白芍藥對的配伍比例為1 ∶1［22-23］。本實驗比較甲醇-水、乙腈-水洗脫系統(tǒng)，由于甲醇在低波長區(qū)吸收明顯，采用最大吸收法產(chǎn)生的基線有波動；在水相中加入磷酸后，阿魏酸和芍藥苷峰形較理想，且各個峰分離效果好、基線平穩(wěn)。故選擇乙腈-磷酸水（0.1%） 為流動 相。對體積流量 （0.7、0.8、0.9 mL／min）、柱溫（30、35、40 ℃） 進(jìn)行考察。0.9 mL／min 較0.8 mL／min 峰型較擁擠，0.7 mL／min 與0.8 mL／min 差別不大，為縮短分析時間，故選擇0.8 mL／min 作為最佳體積流量。在3 種柱溫下色譜峰無明顯差異，為使色譜條件更耐用，選擇35 ℃。對檢測波長（222、230、254、275 nm） 進(jìn)行考察，本研究前期使用DAD 檢測器全波長掃描，在230 nm 波長下基線平穩(wěn)，共有峰數(shù)量多，各個峰吸收較大、干擾較少，且分離度符合檢測要求，部分峰具有較高響應(yīng)值，結(jié)合2015 年版《中國藥典》 最終選擇230 nm 波長進(jìn)行后續(xù)檢測。

3.2 樣品制備 為了方便樣品的保存及檢測到更多成分，本實驗將煎液進(jìn)行濃縮富集。根據(jù)當(dāng)歸-白芍藥對中主要化學(xué)成分的溶解性、極性等性質(zhì)，本研究選擇25%甲醇、乙醇、乙腈；50% 甲醇、乙醇、乙腈；75% 甲醇、乙醇、乙腈及純水作為當(dāng)歸-白芍藥對干膏粉的復(fù)溶溶劑，結(jié)果顯示25%甲醇、乙醇、乙腈，75%乙醇、乙腈超聲后粉末仍未全部溶解，粉末呈棕黃色；50%乙腈、純水作為復(fù)溶溶劑時，各指標(biāo)成分不能充分提取；故細(xì)致考察后，定60%甲醇為復(fù)溶溶劑。供試品溶液制備的超聲時間和功率對當(dāng)歸-白芍藥對的各共有峰峰型無明顯影響，為提高提取效率保證有效成分完全提取，故選超聲及功率分別為30 min、400 W。研究還對當(dāng)歸-白芍藥對浸膏的干燥方式（真空干燥、噴霧干燥及冷凍干燥） 進(jìn)行考察，結(jié)果可知，冷凍干燥后各指標(biāo)成分較為穩(wěn)定，且樣品損失率低，故選擇冷凍干燥。

不同產(chǎn)地18 批樣品與對照指紋圖譜的相似度均大于0.99，表明不同產(chǎn)地的當(dāng)歸-白芍藥對間相似度良好。但單一的相似度評價難以全面地評價不同產(chǎn)地當(dāng)歸-白芍藥對的差異性。為了更全面、整體地分析不同產(chǎn)地當(dāng)歸-白芍藥對的質(zhì)量差異，又采用化學(xué)模式識別系統(tǒng)中聚類分析進(jìn)行分析［24-25］，可明顯區(qū)分不同產(chǎn)地配伍藥對的質(zhì)量。

本研究建立了當(dāng)歸-白芍藥對HPLC 指紋圖譜，對部分共有峰進(jìn)行了化學(xué)成分指認(rèn)。該方法簡便、快捷、準(zhǔn)確且靈敏度高，能夠較全面地反映當(dāng)歸-白芍藥對的化學(xué)成分信息，可用于其全面質(zhì)量控制。