腸康方對(duì)腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠肥大細(xì)胞的影響

任杰，樊欣鈺，范志巍，江晟，陸敏,2*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028)

腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS) 是一種以反復(fù)腹痛，伴排便習(xí)慣改變或大便性狀異常為臨床征象的功能性腸病[1]。臨床上主要分為腹瀉型、便秘型、混合型和不定型4種類型[2]。其中腹瀉型(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D)是最常見類型，有研究表明其占總腸易激綜合征患者的74%[3]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)目前尚無完全有效的治療方法。近年來，中醫(yī)藥以其獨(dú)特診療理念，在IBS的治療上發(fā)揮了很大優(yōu)勢(shì)[4-5]。腸康方是全國(guó)名老中醫(yī)王德明教授在多年的臨證過程中逐漸總結(jié)形成的驗(yàn)方，對(duì)IBS的治療具有獨(dú)特的療效，對(duì)IBS-D療效尤為顯著。為探討腸康方對(duì)IBS-D療效作用的可能機(jī)制，通過建立的IBS-D大鼠模型，觀察其對(duì)模型大鼠結(jié)腸肥大細(xì)胞的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供的SD孕鼠，合格證號(hào)：SCXK (滬)2008-0016，于江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心喂養(yǎng)，室溫22 ℃～26 ℃，自然光照條件，大鼠自由進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

番瀉葉由江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供。腸康方組方：白芍15 g，防風(fēng)6 g，熟地黃5 g，菟絲子5 g，黃連3 g，金蕎麥8 g，蟬蛻3 g；由江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供。匹維溴銨(Abbott Products SAS，規(guī)格：50 mg/片，批號(hào)：H20120127)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

甲苯胺藍(lán)(南京群相生物科技有限公司)；10%甲醛(江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科提供)；5-HT免疫組化試劑盒(上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 造模方法

參考AL-Chaer造模方法[6]并進(jìn)行改良，采用新生期結(jié)直腸刺激聯(lián)合成年后番瀉葉灌胃方法造模，建立IBS-D大鼠模型。SD孕鼠，單獨(dú)飼養(yǎng)，待其生產(chǎn)。選取新生大鼠120只，采用隨機(jī)數(shù)字法分為造模組105只和空白對(duì)照組15只。

2.1.1 新生期結(jié)直腸刺激

分別在造模組幼鼠出生第8、10、12天進(jìn)行結(jié)直腸刺激，將經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)球囊經(jīng)肛門插入結(jié)直腸，球囊完全進(jìn)入后，向球囊內(nèi)注氣，使球囊內(nèi)壓強(qiáng)為60 mm Hg(1 mm Hg≈0.133 kPa),持續(xù)1 min，每日1次，共3次。刺激后與母鼠共同飼養(yǎng)至第22天斷奶。第30天分籠，正常飼養(yǎng)。出生第60天，進(jìn)行AWR檢測(cè)，篩選出腸道高敏感大鼠，進(jìn)行下一步造模。空白對(duì)照組不作任何處理。

2.1.2 番瀉葉水灌胃

將番瀉葉放入5倍體積的開水中浸泡一夜。過濾后取濾液，將其濃縮至濃度為0.45 g/mL。對(duì)篩選出的腸道高敏感大鼠，給予濃度為0.45 g/mL番瀉葉水灌胃，灌胃體積為10 mL/kg，每日1次，持續(xù)2周。空白對(duì)照組不作任何處理。

2.2 動(dòng)物分組

造模結(jié)束后，將造模成功的75只大鼠，隨機(jī)分成5組，分別為模型對(duì)照組、陽性藥物組、腸康方高劑量組、腸康方中劑量組和腸康方低劑量組，每組各15只。

2.3 藥物干預(yù)

按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究等效劑量的計(jì)算方法，即按60 kg/200 g人鼠轉(zhuǎn)換系數(shù)w=6.25計(jì)算等效劑量，腸康方高、中、低劑量組分別18.75、9.38、4.69 g/(kg·d)的劑量灌胃。陽性藥物組以匹維溴銨懸浮液按照15 mg/(kg·d)的劑量灌胃。空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等容積的蒸餾水灌胃。每天上午9時(shí)灌胃，1次/d，持續(xù)2周。

2.4 模型評(píng)價(jià)

2.4.1 大鼠一般情況

觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、活動(dòng)情況等。

2.4.2 大鼠排便情況

觀察各組大鼠造模后及藥物干預(yù)后的排便情況。

2.4.3 腹壁撤退反射(Abdominal Withdrawal Reflex，AWR)

AWR用于評(píng)估內(nèi)臟敏感性變化，是評(píng)價(jià)內(nèi)臟痛的可靠指標(biāo)。操作如下：實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，將大鼠放入自制的玻璃容器中，使其只能前后運(yùn)動(dòng)。將8F導(dǎo)尿管自肛門出入，待球囊末端深入肛門1 cm為止。待大鼠平穩(wěn)安靜后，向?qū)蚬軆?nèi)注氣，使球囊內(nèi)壓強(qiáng)分別為10 mm Hg，20 mm Hg，40 mm Hg，60 mm Hg，80 mm Hg。每個(gè)壓強(qiáng)持續(xù)20 s，觀察大鼠在各個(gè)壓強(qiáng)下的反應(yīng)，對(duì)其進(jìn)行評(píng)分。每個(gè)壓力值檢測(cè)3次，取其平均值。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]，0分：無行為反應(yīng)；1分：身體靜止不動(dòng)，頭部短暫運(yùn)動(dòng)；2分：腹部肌肉收縮，但未抬離底面；3分：腹肌收縮并抬抬起；4分：骨盆抬起，身體呈弓形。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)及方法

2.5.1 肥大細(xì)胞(mast cells，MC)計(jì)數(shù)

藥物干預(yù)14 d后，禁食不禁水24 h，將各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉。剖腹，從距離回盲連接處2 cm開始向肛門方向取結(jié)腸1 cm，投入10%中性甲醛溶液固定，切片行甲苯胺藍(lán)染色，光鏡下計(jì)數(shù)肥大細(xì)胞數(shù)目。

2.5.2 5-HT平均光密度值

緊鄰上一段另取一段約1 cm結(jié)腸，甲醛固定，石蠟包埋，切片后行5-HT免疫組化染色。免疫組化染色后，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為陽性反應(yīng)，無棕黃染色為陰性。應(yīng)用Image Pro Plus 軟件測(cè)定其陽性表達(dá)的光密度(optical density，OD)值進(jìn)行半定量分析，以測(cè)定結(jié)腸黏膜5-HT水平。棕黃染色越多，OD值越大，5-HT水平越高。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 一般情況

空白對(duì)照組大鼠精神良好，毛發(fā)光澤，飲食正常。模型對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)較差，活動(dòng)減少，毛發(fā)失去光澤，飲食減少。藥物干預(yù)組大鼠，經(jīng)腸康方及匹維溴銨藥物干預(yù)后，精神逐漸恢復(fù)正常，活動(dòng)增加，毛發(fā)逐漸恢復(fù)光澤，飲食增加。

3.2 大鼠排便情況

空白對(duì)照組大鼠糞便正常，模型對(duì)照組大鼠造模后糞便變軟，或成稀狀，經(jīng)腸康方及匹維溴銨藥物干預(yù)后，腹瀉逐漸消失，糞便逐漸恢復(fù)正常。

3.3 腹壁撤退反射(AWR)

藥物干預(yù)結(jié)束后，用AWR評(píng)估各組大鼠的內(nèi)臟敏感性。與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠在不同球囊壓力的AWR的評(píng)分均升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明模型對(duì)照組大鼠內(nèi)臟呈高敏感。與模型對(duì)照組相比，陽性藥物組和腸康方高、中、低劑量組大鼠在不同球囊壓力的AWR的評(píng)分均降低(P<0.05),說明陽性藥物組和腸康方高、中、低劑量組大鼠內(nèi)臟高敏感有所緩解，匹維溴銨和腸康方均可降低IBS-D模型大鼠AWR評(píng)分。見表1。

表1 各組大鼠AWR評(píng)分比較

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型對(duì)照組相比，#P<0.05。

3.4 大鼠結(jié)腸黏膜MC計(jì)數(shù)

MC經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)MC主要分布在黏膜下層及黏膜固有層，MC胞核呈藍(lán)色，胞質(zhì)紫紅色。與空白組相比，模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜MC數(shù)量顯著增多(P<0.01)。與模型對(duì)照組相比，腸康方高、中、低劑量組大鼠結(jié)腸黏膜MC數(shù)量均顯著減少(P<0.01)。提示腸康方高有減少IBS-D模型大鼠結(jié)腸MC的作用。見表2、圖1。

表2 各組大鼠結(jié)腸肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)個(gè))

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.01；與模型對(duì)照組相比，#P<0.01。

圖1 各組大鼠腸肥大細(xì)胞情況(甲苯胺藍(lán)染色，×400)

3.5 大鼠結(jié)腸黏膜5-HT水平

結(jié)腸黏膜行5-HT免疫組化染色后，顯微鏡下觀察，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野截取圖像，采用Image Pro Plus 軟件分別測(cè)定其OD值，取其平均值，作為該標(biāo)本的平均值。模型對(duì)照組OD值明顯升高，與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜5-HT水平明顯高于空白對(duì)照組大鼠。腸康方高、中、低劑量組OD值顯著低于模型對(duì)照組(P<0.01)，說明腸康方高、中、低劑量組大鼠腸黏膜5-HT水平顯著低于模型對(duì)照組。見表3、圖2。

表3 各組大鼠結(jié)腸黏膜5-HT OD值比較

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.01；與模型對(duì)照組相比，#P<0.01。

圖2 各組大鼠結(jié)腸黏膜5-HT水平(免疫組化染色，×200)

4 討論

IBS的病理機(jī)制目前尚未完全清楚，主要包括內(nèi)臟高敏感、腦腸軸異常、消化道感染、胃腸動(dòng)力異常以及精神心理等多方面因素，極為復(fù)雜[8]。近年來，隨著對(duì)IBS-D的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)腦-腸互動(dòng)機(jī)制在IBS-D發(fā)病過程中起到了重要作用，并針對(duì)此機(jī)制提出了“腦-腸軸”的概念[2]。參與腦-腸互動(dòng)機(jī)制的神經(jīng)遞質(zhì)稱為腦腸肽，主要有5-HT、血管活性腸多肽(VIP)、P物質(zhì)(SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(cGRP)等。其中5-HT是腦腸軸中最主要的神經(jīng)遞質(zhì)，而人體內(nèi)大部分的5-HT來源于胃腸道。

腸MC是合成、分泌和儲(chǔ)存5-HT的功能細(xì)胞[9]，在腦腸軸信息傳遞及內(nèi)臟高敏感的形成中發(fā)揮著重要的作用[10-11]。MC 主要位于腸黏膜固有層下的神經(jīng)和血管附近，是神經(jīng)-免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)的重要組成部分[12]。正常狀態(tài)下，MC 不會(huì)被激活，當(dāng)發(fā)生應(yīng)激后，MC脫顆粒活化，釋放多種活性物質(zhì)，進(jìn)而降低內(nèi)臟感覺閾值[13]。5-HT是MC脫顆粒釋放的重要活性介質(zhì)之一，與消化道的運(yùn)動(dòng)、分泌與吸收以及內(nèi)臟感覺均有著密切關(guān)系[14]。有研究表明，當(dāng)患者患有IBS-D時(shí)，其腸黏膜中MC數(shù)量增多，血漿5-HT水平增高，同時(shí)在腸黏膜MC周圍，5-HT免疫陽性的神經(jīng)纖維表達(dá)亦增強(qiáng)[15]。5-HT通過激活5-HT受體，將信號(hào)由內(nèi)臟傳入神經(jīng)及腸神經(jīng)系統(tǒng)，并傳入神經(jīng)中樞，進(jìn)而導(dǎo)致大腦對(duì)痛覺高敏感[16]。由此可見，通過調(diào)節(jié)5-HT，腸MC在IBS-D的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。

本研究結(jié)果顯示,腸康方能夠明顯改善IBS-D模型大鼠的腹瀉癥狀，明顯降低其AWR評(píng)分(P<0.05)，改善其腸道高敏感狀態(tài)。同時(shí)，腸康方能夠明顯減少IBS-D模型大鼠結(jié)腸MC的數(shù)量，說明結(jié)腸MC數(shù)量的變化與IBS-D的發(fā)生密切相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。不同劑量的腸康方均能減少IBS-D模型大鼠結(jié)腸MC的數(shù)量(P<0.01)。雖然組間比較不同劑量組之間未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但高、中、低劑量組從數(shù)值變化上，表現(xiàn)出對(duì)MC數(shù)量的影響呈降低趨勢(shì)，并以高劑量組為優(yōu)。說明隨著給藥劑量的增加，腸康方對(duì)IBS-D模型大鼠腸MC作用逐漸增強(qiáng)。另外，腸康方能明顯降低模型大鼠結(jié)腸黏膜5-HT水平，說明結(jié)腸5-HT水平的變化亦與IBS-D的發(fā)生密切相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。而結(jié)腸黏膜5-HT水平的變化與結(jié)腸MC的數(shù)量變化相一致，說明腸康方治療IBS-D的作用機(jī)制可能同時(shí)與MC和5-HT有關(guān)。

根據(jù)IBS-D的主要臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于“腹痛”“泄瀉”等范疇，其病位涉及肝、心、脾、胃、腎、大小腸等臟腑。王德明教授認(rèn)為IBS-D主要病機(jī)是脾虛肝郁、心腎不交。其創(chuàng)制的腸康方，以白芍、防風(fēng)為君藥，養(yǎng)血柔肝、散肝舒脾，使疏肝也能達(dá)到脾健的效用；熟地黃、菟絲子、黃連為臣藥，滋腎陰、補(bǔ)腎陽、清心火，三藥同用，則心腎交通，陰平陽治，滋水涵木，情志得遂；金蕎麥、蟬蛻為佐藥，清肺熱、疏風(fēng)解痙，肺合大腸，肺降則腸安。全方諸藥合用，共奏調(diào)和肝脾、交通心腎、緩?fù)粗篂a、寧神暢情之功。

綜上所述，腸康方對(duì)IBS-D的療效顯著，其作用機(jī)制可能是通過對(duì)腸黏膜MC的調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控腦腸軸中5-HT信號(hào)系統(tǒng)，降低5-HT的濃度，以改善大鼠腸道高敏感狀態(tài)。