間接競爭ELISA法檢測黃連解毒湯中黃芩苷在大鼠腦脊液中的分布

劉佳星 趙琰 王蘇娜 王曉克 羅娟 孔慧

黃連解毒湯最早源于葛洪《肘后備急方》卷二“治傷寒時氣溫病方第十三”，但未出方名[1]，距今1700多年的歷史，是清熱解毒的經典方劑[2]。其異名在《脈因證治》上稱火劑湯、《醫學心悟》中稱三黃解毒湯。黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味中藥材按3∶2∶2∶3比例配伍組成，以黃連瀉心火兼瀉中焦之火為君，黃芩清肺熱、瀉上焦之火為臣，黃柏瀉下焦之火，梔子通瀉三焦之火、導熱下行，合為佐使，共收瀉火解毒之功,用治大熱煩躁，口燥咽干，錯語不眠；或熱病吐血、衄血；或熱甚發斑，或身熱下利，或濕熱黃疸；或外科癰瘍疔毒,小便黃赤，舌紅苔黃，脈數有力。無論內服、外服，均有良好的治療作用[3-4]。

黃連解毒湯的現代研究表明，它對多種感染性疾病[5]、內分泌代謝性疾病以及一些免疫系統疾病[6]都有良好的臨床療效。對于缺血性中風[7]、頸動脈斑塊[8]、阿爾茨海默病、2型糖尿病[9]等亦有很好的治療作用。

藥代動力學方面的研究在一定程度上揭示了黃連解毒湯中黃芩苷的作用機理，但是相對而言，黃連解毒湯治療腦部中風和一些神志方面的疾病時，是否對靶部位有直接作用、其有效成分是否可以透過血腦屏障、在腦中的代謝情況又是如何等問題至今未見報道。藥物到達靶部位是藥物起效的關鍵方式之一，這其中已有研究表明梔子苷可以透過血腦屏障[10]，通過抗氧化[11-12]等方式改善腦缺血導致的一些癥狀，那么黃芩苷作為黃連解毒湯中黃芩的主要成分之一，是否也能夠透過血腦屏障直接對腦部產生作用，是本實驗需要解決的問題。

因此本論文在大鼠灌胃給藥后1小時、2小時、3小時、4小時四個時間點分別抽取腦脊液，用icELISA法檢測黃芩苷在腦脊液中的含量，用以觀察黃連解毒湯中黃芩苷在腦脊液中的代謝情況，在一定程度上可以反映黃連解毒湯在腦部的分布特征。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

HC-2518R高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.，Ltd)；96孔酶標板(NVNC丹麥賽默飛公司)；酶標儀(BioTek美國博騰儀器有限公司ELx800酶標儀)。

1.2 試劑

黃連解毒湯制備藥材購于北京仟草中藥飲片有限公司，黃芩苷對照品(Shanghai Standard Biotech Co，Ltd批號：1596/10595，純度≥98.0%)；其他相關藥品如碳酸鹽和Tween-20等均為國產分析純；酶標二抗(HRP標記羊抗鼠IgG，GeneScript公司)；四甲基聯苯胺(TMB，美國Amercso公司)。

1.3 樣品制備

黃連解毒湯的制備按黃連解毒湯的處方比例，分別稱取黃連、黃芩、黃柏、梔子四味藥材各90 g、60 g、60 g、90 g，加水6倍量，煎煮三次，每次1.5小時，濾過，濾液濃縮至稠膏(1.37 g/mL原藥材)。

1.4 樣品采集

50只Sprague-Dawley(SD)健康大鼠(220±10)g，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK(京)2012-0001。

將健康的SD大鼠隨機分為5組，分別是1小時組、2小時組、3小時組、4小時組，每組6只，以及空白組26只，進行試驗。

給藥劑量：SD大鼠按人公斤體重的6倍量進行折算，為了保證在腦部組織能夠檢測出黃芩苷，大鼠的給藥劑量是折算劑量的5倍，每只大鼠灌胃2.5 mL。

實驗前禁食不禁水12小時，將制備好的黃連解毒湯灌胃給藥，分別于給藥后1小時、2小時、3小時、4小時抽取腦脊液。

腦脊液抽取：采用手持大鼠頭部固定體位的腦脊液抽取方法。將大鼠用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉，麻醉后將頭頸部所需部位鼠毛剃除干凈，參照任長虹報道大鼠腦脊液抽取方法并進行改進[13]，將大鼠的頭部按角度固定在腦固定儀上，采樣者手持1 mL注射器進針，進針角度與頭部成約135°角。針尖坡面向上緩慢向前進針到小腦延髓池，深度約為0.5 cm。緩慢抽取80～100 μL腦脊液后迅速退針，將腦脊液注入1.5 mL的EP管中，置-40℃冰箱儲存備用，大鼠處死。

1.5 icELISA法檢測黃芩苷

1.5.1 黃芩苷標準溶液的制備 精密稱取黃芩苷約5 mg，PBS溶解，配成100 μg/mL的母液。取母液50 μL，加腦脊液稀釋至10 μg/mL，然后用腦脊液依次5倍稀釋，直至稀釋到3.2 ng/mL，獲得濃度范圍從3.2～2000 ng/mL的系列標準溶液。

1.5.2 icELISA檢測步驟 實驗前所有試劑室溫平衡30分鐘；用CBS(碳酸鹽緩沖液0.05 mol/L，pH為9.6)稀釋包被原BAL-BSA(1∶5000)，以100 μL/孔包被到96孔板，37℃孵育2小時，用PBST洗板4次后，再用脫脂奶粉(5 g溶于100 mL去離子水中)250 μL/孔封閉。放入4℃冰箱過夜，PBST洗版3次，備用。

向包被好的96孔微孔板中加入待測樣品或黃芩苷標準溶液50 μL/孔，空白孔加入等量空白腦脊液，放入37℃溫箱孵育1小時，取出后PBST洗板3次；以黃芩苷對照品質量濃度為0的測定孔為陽性對照孔，加入以PBS按照1∶10000稀釋的酶標二抗，每孔100 μL，于37℃溫箱孵育30分鐘；取出后用PBST洗板3次，每孔加入100 μL的TMB顯色液，37℃溫箱顯色15分鐘；以2 mol/L硫酸溶液50 μL/孔終止反應。將整塊微孔板置于酶標儀，測定各孔在波長450 nm處的吸光度A值。

1.6 方法學考察

1.6.1 線性關系 取以上配制的濃度范圍從3.2～2000 ng/mL系列黃芩苷標準溶液按以上icELISA檢測步驟進行檢測。根據檢測結果，以A/A0(A0為空白孔OD值，A為檢測孔OD值)為y軸，黃芩苷濃度的自然對數為x軸，建立競爭抑制曲線，計算線性范圍。

1.6.2 精密度 取以上標準溶液中400 ng/mL、80 ng/mL和3.2 ng/mL 3個濃度的黃芩苷標準溶液，按照以上的icELISA檢測步驟進行測定，每個濃度設5個平行孔，每條標曲用1塊板測定，得出板間精密度。

1.6.3 回收率 在空白大鼠腦脊液中定量加入黃芩苷標準品，配制成濃度為400 μg/mL、80 μg/mL和3.2 μg/mL的黃芩苷腦脊液溶液，每個濃度設5個復孔檢測。回收率計算公式如下：回收率=(黃芩苷檢測濃度/黃芩苷加入濃度)×100%。

1.6.4 樣品檢測 取腦脊液室溫溶解，置高速離心機內10000 rpm，離心4分鐘，溫度4℃，取上清液，加入包被好的96孔板，按以上檢測步驟進行檢測。

2 結果

2.1 線性關系

以A/A0(A0為空白孔OD值，A為檢測孔OD值)為Y軸，黃芩苷濃度的自然對數為X軸，建立競爭抑制曲線，線性擬合回歸方程為：y=0.1069ln(x)+1.0144，R2=0.9885。見圖1。

圖1 黃芩苷在腦脊液中的線性關系

2.2 精密度

通過檢測，得出精密度見表1。從表1可以看出，小鼠腦脊液中高、中、低3種濃度黃芩苷含量檢測的精密度分別為13.14%、6.65%、6.04%，數據均≤15%，能夠滿足檢測需求。

表1 icELISA法測定不同濃度黃芩苷標準溶液的精密度

2.3 回收率

按照回收率計算公式：回收率=(黃芩苷檢測濃度/黃芩苷加入濃度)×100%,測得結果見表2。從表2可以看出，檢測高、中、低3個濃度血漿溶液中黃芩苷的回收率分別為91.35%、87.04%和117.67%(SD≤15%)，均在±20%之內，可以滿足生物樣品的檢測要求。

表2 icELISA法測定不同濃度黃芩苷血漿溶液中標準溶液的回收率

2.4 樣品檢測

從給藥后1小時、2小時、3小時和4小時腦脊液中黃芩苷的平均含量可以看出，在給藥2小后黃芩苷在大鼠腦脊液中含量達到峰值，隨后下降，且下降速度較快，在給藥4小時后腦脊液中黃芩苷含量最低。見表3。

表3 黃芩苷在腦脊液中的藥物分布經時表

3 討論

黃連解毒湯在治療多種腦部疾病方面有著切實的臨床療效，其中黃芩苷(7-O-β-D葡萄糖醛酸)作為黃芩的主要有效成分發揮著重要作用。目前黃芩苷藥代動力學研究的主要檢測手段是高效液相色譜法和質譜法等，但是由于這些方法的樣品需要純化等前處理步驟，對采樣量需求較大，難以完成中藥復方在腦脊液中的含量檢測，這也是一直未見報道黃連解毒湯主要成分黃芩苷在腦積液中分布的原因。本實驗從每只大鼠中每次只能獲得100 μL左右的腦脊液，樣品離心后就可以直接用于檢測，不需要進行除蛋白等前處理程序，所以才具有了開展此項研究的可能性。

本實驗室前期自制了黃芩苷單克隆抗體，并對抗體的特異性等進行了檢測，如果將制備的黃芩苷單抗對黃芩苷的交叉反應率定為100%，結果與黃連解毒湯中含有的主要成分梔子苷、葛根素、大豆苷等的交叉反應率均<0.10%，表明此抗體的特異性良好[14]。而且，黃芩苷在胃腸道幾乎不被吸收，需要轉化成黃芩素吸收入血，但是在進入血液后又被還原成黃芩苷，故在血液和組織中檢測到的仍然是黃芩苷[15]。另外，本實驗室基于黃芩苷單克隆抗體建立的ELISA檢測方法，與HPLC檢測結果一致，詳見蘇歆等在《藥物分析雜志》的報道[16]。

鑒于中藥復方成分的復雜性和樣品含量相對較低的特點，其組織分布研究一般是取給藥后某一個時間點的組織進行檢測。雖然像HPLC-MS/MS這種高端儀器設備已經普遍應用于中藥藥代和組織分布的研究，但是其對樣品的制備較為嚴格和繁瑣，限制了其開展廣泛的研究。icELISA法具有特異性高、樣品處理簡單、樣品用量少(50 μL就可以滿足檢測量的需求)、靈敏度高(與液質聯用的靈敏度相當)、檢測時間快、樣品處理量大、對環境無污染等特點，非常適合中藥復方的藥代動力學和組織分布研究。本實驗在以往黃芩苷藥代動力學的研究基礎上，對采樣時間點設計了給藥后1小時、2小時、3小時和4小時四個時間點，既能反應黃芩苷在腦部分布的經時特征，又沒有犧牲大量動物。

在臨床實踐中，有時用腦脊液藥物濃度水平作為藥物腦組織穿透力的證據，甚至有時用腦脊液藥物濃度代替感染部位的藥物濃度預測療效[17]。但腦脊液的提取具有一定難度，所以研究相對較少。大量研究表明,黃芩苷對腦缺血具有神經保護作用[17]，但黃芩苷是否可以透過血腦屏障到達作用的靶部位，至今未見報道。本實驗利用icELISA檢測法首次從腦脊液中檢測到了黃芩苷，對黃芩苷能夠透過血腦屏障提供了直接的證據。

通過實驗，作者證明了黃芩苷可以通過血腦屏障。結合現有研究認為黃芩苷對缺血性腦中風的保護作用可能與抗氧化、抗炎、抗興奮性毒性和促進神經再生作用有關[18]。因此，本研究為黃連解毒湯治療中風等疾病的臨床應用奠定了一定的實驗基礎，也為日后治療腦病疾病合理用藥提供了依據。