基于液質聯用技術的肺痹湯有效成分測定及藥代動力學特征初探

郝慶勛 李國棟 韋婉 謝潔 焦揚

“肺痹湯”為首都國醫名師周平安教授治療間質性肺疾病的常用經驗方，可明顯改善特發性肺纖維化患者咳嗽、氣短等呼吸道癥狀，并有效地減少年平均肺部感染次數，提高生存質量，延長生存期。全方以益氣解毒，化痰通絡為法，由生黃芪、金銀花、浙貝母、丹參等組成，寒熱并用，補中寓通，共奏益氣解毒活血、清熱化痰通絡之功效。本課題組前期在動物實驗中發現，肺痹湯具有抗博來霉素大鼠肺纖維化作用，其主要機制可能是肺痹湯可降低博來霉素大鼠血清中細胞外基質含量[1]；在體外實驗中，本課題組發現肺痹湯及其主要成分對人胚肺成纖維二倍體細胞(medical research council cell strain 5，MRC-5)的增殖具有抑制作用[2]。為進一步明確肺痹湯水煎劑及入血成分，本實驗基于液相色譜-串聯質譜法技術(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)，測定肺痹湯水煎劑及灌胃大鼠體內血藥濃度變化，研究口服肺痹湯后其主要成分在大鼠體內的代謝變化，為該方治療間質性肺疾病提供實驗依據，為臨床合理用藥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠19只，雌雄不限，SPF級，體重(250±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證編號：SCXK(京)2016-0006，合格證號：11400700248337。所有動物均適應性喂養一周后使用。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 肺痹湯的組成：生黃芪、金銀花、浙貝母、丹參、當歸、穿山龍、生甘草，購自北京同仁堂飲片有限責任公司，經鑒定為正品，符合《中華人民共和國藥典》要求。肺痹湯水煎劑由北京中醫藥大學東方醫院藥房按照質量比3∶3∶2∶2∶2∶2∶1比例，濃煎成生藥濃度為2.83 g/mL的復方制劑，置于4℃冰箱中低溫保存。檢測時將肺痹湯水煎劑稀釋4倍(取5 mL復方制劑加入15 mL超純水，置于渦旋機混勻)，取出1 mL稀釋液于EP管中，置于高速冷凍離心機內離心處理(1400 rpm，10 min，4℃)，離心完畢后取80 μL上清液進行質譜檢測。對照標準品：芒柄花甘(批號：OB12877)，綠原酸(批號：OB12831)，貝母素乙(批號：OB12894)，甘草酸(批號：OB12897)，甘草苷(批號：OB12809)，薯蕷皂苷(批號：OB12823)，丹酚酸B(批號：OB12871)，環黃芪醇(批號：OB12803)，丹參酮IIA(批號：OB12852)，肉桂酸(批號：OB12834)，均購自北京歐北生物科技有限公司，純度均≥98%。乙腈、甲酸為色譜純；甲醇為分析純(美國Fisher公司)。實驗用水為超純水。

1.2.2 儀器 UPLC分析檢測肺痹湯水煎劑(美國Waters SYNAPT G2儀)；UPLC分析檢測肺痹湯灌胃大鼠含藥血漿(美國Waters ACQUITYUPLC儀)；渦旋振蕩器(型號VORTEX-5)；R200D型電子分析天平(德國Sartorius公司)；UV型超純水機(美國Millipore公司)；ME235S電子分析天平(德國Sartourious公司)；高速冷凍離心機(型號：Centrifuge 5427 R，上海年悅儀器公司)；可視氮吹儀(型號KD200，上海滬粵明科學儀器有限公司)；KQ-250DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，20 mL、100 mL Research plus移液槍(德國 Eppendorf公司)。

1.3 溶液的制備

標準品溶液制備：天平精準稱量甘草苷、甘草酸、貝母素乙、環黃芪醇、綠原酸、芒柄花甘、肉桂酸、丹酚酸并用純甲醇溶解，配成標準品儲備液，再用甲醇溶液稀釋成1600 ng/mL、800 ng/mL、400 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、20 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL的工作液，貯藏在4℃冰箱中冷藏待用。

1.4 色譜條件

1.4.1 肺痹湯水煎劑檢測色譜條件 以0.1‰甲酸-水(A)和乙腈(B)為流動相，分離色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm)。柱溫45℃，流速0.4 mL/min，進樣體積2 μL。梯度洗脫程序為：0～10 min，5%→20% B；10～15 min，20%→95% B；15～20 min，95% B；20.1～25 min，5% B。

1.4.2 肺痹湯灌胃大鼠含藥血漿檢測色譜條件 以0.1‰甲酸-水(A)和甲醇(B)為流動相，分離色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。柱溫40℃，流速0.3 mL/min，進樣體積2 μL。梯度洗脫程序為：0～1 min，5% B；1～3 min，5%→50% B；3～4 min, 50%→95% B；4～5 min，95% B。

1.5 質譜條件

1.5.1 肺痹湯水煎劑檢測質譜條件 質譜分析使用UPLC-Q-TOF質譜儀。實驗參數：毛細管電壓2.7 kV，離子源溫度120℃，錐孔電壓：40 V，脫溶溫度400℃，脫溶氣體流量800 L/h。

1.5.2 肺痹湯灌胃大鼠血漿檢測質譜條件 質譜分析使用Xevo TQ-S質譜儀(Waters，Milford，MA，USA)。實驗參數：毛細管電壓2.5 kV，脫溶溫度400℃，脫溶氣體流量800 L/h，錐形氣體流150 L·h-1，采用多反應監測的質譜掃描方式；測定芒柄花甘檢測離子；m/z 475.1583-267.1373；甘草苷檢測離子：m/z 417.2221-255.1298；綠原酸檢測離子：m/z 353.1908-191.1373；內標的檢測離子：m/z 147.2119-103.1623；用進樣器取20 μL供試品，注入高效液相儀。每種分析物的碰撞能量和錐電壓根據多重反應監測設定。定量數據由Waters Mass Lynx TM Software 4.1獲取和處理。

1.6 肺痹湯灌胃大鼠血漿制備

1.6.1 單次給藥組 SD大鼠19只，隨機選取7只作為單次給藥組，實驗前12小時禁食，自由飲水。按10 mL/kg給大鼠以肺痹湯水煎劑灌胃。單次給藥組灌胃1次后開始采血。于灌胃后0 h、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h經股動脈插管采血0.5 mL，共12次，放置于肝素化EP管中，以4000 rpm于高速冷凍離心機中離心10分鐘，完畢后取上層血漿200 μL，放置于-20℃冰箱待測。

1.6.2 給藥7天組 SD大鼠19只，隨機選取7只作為給藥7天組，實驗前12小時禁食，自由飲水。按10 mL/kg給大鼠以肺痹湯水煎劑灌胃，連續給藥7天，每日1次。于第7次灌胃后0 h、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h經股動脈插管采血0.5 mL，共12次，放置于肝素化EP管中，以4000 rpm于高速冷凍離心機中離心10分鐘，完畢后取上層血漿200 μL，放置于-20℃冰箱待測。

1.6.3 空白對照組 SD大鼠19只，隨機選取5只，灌胃等量生理鹽水7天，末次灌胃后1小時經腹主動脈采血，每只采血量約5 mL，室溫下靜置4小時后離心(4℃，4000 rpm，15 min)，分離上清液約20 ml，放置于-20℃冰箱待測。

1.7 血漿樣品處理方法

室溫下融化血漿樣品，精確吸取100 μL樣品，加入20 μL內標肉桂酸溶液，渦旋混勻，再加入300 μL甲醇沉淀蛋白，將沉淀蛋白后溶液置于離心機中，以14000 rpm離心10 min，取上清液，于30℃氮吹儀中氮氣吹干，用100 μL甲醇復溶，渦旋混勻后，與高速冷凍離心機中以14000 rpm離心10 min，取上清液進行質譜檢測。

1.8 方法學質控樣品制備

1.8.1 精密度與重復性質控樣品制備 分別制備芒柄花甘、綠原酸、甘草苷的低、中、高濃度為20、200和1200 ng/mL 的血漿質控樣品，按照血漿樣品處理方法準確處理樣品，每個濃度分別平行制備3份，重復3個批次。根據每批的當日標準曲線計算質控樣品所測定濃度的相對標準偏差值(relative standard deviation，RSD)，從而考察精密度與重復性。

1.8.2 基質效應與回收率質控樣品制備 分別制備芒柄花甘、綠原酸、甘草苷的低、中、高濃度分別為20、200和1200 ng/mL的血漿質控樣品，按照血漿處理方法，每個濃度分別平行制備3份，以低、中、高3個濃度的大鼠血漿樣品測得的峰面積與大鼠空白血漿經蛋白沉淀處理后加入相應濃度的對照品溶液的峰面積之比，計算回收率RSD值。以上述大鼠空白血漿加入對照品溶液的峰面積與對應濃度的對照品溶液的峰面積之比，計算方法的基質效應RSD值。

1.8.3 穩定性質控樣品制備 分別制備芒柄花甘、綠原酸、甘草苷的低、中、高濃度分別為20、200和1200 ng/mL的血漿質控樣品，每個濃度分別平行制備6份，按照血漿處理方法，將處理好的質控樣品于室溫下分別放置0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，按照血漿檢測色譜的條件分別上機檢測，記錄峰面積并計算相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.9 統計學處理

所得血藥濃度—時間數據以Phoenix WinNonlin 7.5軟件計算藥動學參數，由 Microsoft excel 2010進行數據整理和制圖。

2 結果

2.1 標準曲線制備

分別取100 μL空白大鼠血漿依次加入100 μL濃度為1、5、20、50、200、400、800、1600 ng/mL的系列混合對照品溶液和20 μL內標溶液，按照血漿樣品處理方法對樣品進行處理和測定，每個濃度平行制備3份樣品，每條標準曲線包含8個濃度。分別以對照品濃度(X)為橫坐標，以對照品峰面積與內標峰面積比值(Y)為縱坐標，用加權(1/C)最小二乘法進行線性回歸，建立各成分在大鼠血漿中的標準曲線。結果表明:芒柄花甘血漿藥物濃度的回歸方程為：y=34.3544x+665.491，r=0.996；綠原酸回歸方程：y=61.4076x+18187.6，r=0.998；甘草苷回歸方程：y=134.778x+362.923，r=0.995；(權重=1/X2)。線性范圍為1～1600 ng/mL。定量下限為1 ng/mL。

2.2 方法學實驗結果

將“1.8”中各組血漿質控樣品按照相應方法條件檢測后，得出實驗結果，見表1。

2.3 肺痹湯及血漿質量控樣品檢測圖譜

取上述肺痹湯水煎劑上清液，空白血漿上清液，含藥血漿上清液按條件進行檢測。結果表明，通過將肺痹湯水煎劑與“1.1”中制備的標準品溶液進行相對分子質量比對后，共得出9種有效成分，包括甘草苷、甘草酸、綠原酸、丹參酮、芒柄花甘、貝母素乙、環黃芪醇、丹酚酸B、薯蕷皂苷。色譜圖見圖1。

表1 方法學實驗結果

將大鼠灌胃7天的含藥血漿圖譜與“1.3”制備的標準品對照液進行相對分子質量比對后，得出3種入血成分，分別是：芒柄花苷、綠原酸、甘草苷。對比后發現三種化合物的表達時間分別是：芒柄花甘為9.1分鐘，綠原酸為1.19分鐘，甘草苷為5.1分鐘，空白血漿中內源性雜質及其他雜質不干擾血漿樣品的測定，其他峰可能為代謝產物。色譜圖見圖2。

2.4 大鼠含藥血漿藥代動力學參數測定

2.4.1 單次給藥組 單次給藥組的血漿，按照血漿樣品條件進行處理，計算血藥濃度，通過Phoenix WinNonlin 7.5軟件計算藥代動力學參數，結果見表2。

表2 單次給藥組藥代動力學參數

2.4.2 給藥7天組 給藥7天組的血漿，按照血漿樣品條件進行處理，計算血藥濃度，通過Phoenix WinNonlin 7.5軟件計算藥代動力學參數，結果見表3。

注：A甘草苷；B甘草酸；C綠原酸；D丹參酮；E芒柄花甘；F貝母素乙；G環黃芪醇；H丹酚酸B；I薯蕷皂苷圖1 肺痹湯水煎劑九種有效成分圖譜

注：A大鼠空白血漿；B大鼠灌胃7天血漿。圖2 大鼠空白血漿和大鼠灌胃7天血漿圖譜

表3 給藥7天組藥代動力學參數

3 討論

目前中藥血清藥理學研究主要針對單味藥，以中藥復方為研究對象的尚不多見。在臨床工作中，中藥治療間質性肺疾病療效肯定[3]。本課題組的前期研究表明，肺痹湯含藥血清可抑制成纖維細胞的增殖，減少TGF-β1的分泌，阻斷TGF-β1/Smad信號通路，從而減少膠原的合成與分泌，減輕纖維組織的增生[2]。肺痹湯方中以生黃芪為君，具有補肺益氣，益衛固表功效；金銀花為臣，辛散宣透，清熱解毒，通絡散結，切合肺纖維化肺絡痹阻的病機；生黃芪、當歸相配伍補氣行血，益氣以行血通絡；浙貝母可清熱化痰，散結開郁；丹參活血祛瘀，安神除煩；穿山龍祛風除濕，止咳化痰，活血通絡，諸藥配伍可益氣解毒，化痰通絡。處方中生黃芪主要成分之一為芒柄花甘，具有調節機體免疫功能，拮抗病毒作用[4-5]；金銀花主要成分為綠原酸，具有抗菌抗病毒，抗炎解熱作用[6-7]；生甘草中甘草苷具有鎮咳平喘、抗炎、調節機體免疫功能作用[8-9]。有關實驗表明穿山龍主要成分薯蕷皂苷元可以降低MRC-5細胞增殖，起到抗纖維化作用[10]。肺痹湯經過多年臨床實踐，可明顯改善特發性肺纖維化患者咳嗽、氣短等呼吸系統相關癥狀，有效地改善了患者的生存質量[11-12]。

LC-MS是現代藥物研究中不可或缺的技術，尤其以分離度高、靈敏度高、專屬性強、速度快等優勢廣泛應用于中藥化學成分的研究。在前期的臨床與實驗研究基礎上，本研究為進一步明確肺痹湯有效物質基礎，參照生物利用度和生物等效性試驗的指導原則及相關實驗方法，建立了LC-MS方法。實驗結果表明，肺痹湯中的生黃芪、金銀花、生甘草等藥物的有效成分可以在大鼠血漿中測出，可見，本方的臨床療效具有明確的藥物化學物質基礎。

本實驗優化了肺痹湯中相關成分的檢測條件，在ESI離子化方式下，芒柄花甘、綠原酸、甘草苷在負離子模式檢測的響應高于正離子模式下的響應。此方法便于快速檢測灌胃復方后的大鼠體內肺痹湯的有效成分。在對樣品進行預實驗處理時，由于肺痹湯檢測成分都為水溶性的物質，極性較大，查閱相關資料發現，水溶性大的物質若采用液-液萃取的方法其提取率較低，本實驗使用甲醇蛋白沉淀的方法方便快速，可以得到較為理想的質譜響應。

本研究為肺痹湯藥效物質基礎研究提供了一定實驗依據，為進一步開展治療機制研究奠定基礎。通過藥代動力學參數分析后可知，給藥7天組與單次給藥組比較，AUC0-t、Cmax明顯增高，MRT0-t顯著升高，t1/2顯著延長，CLz/F明顯減少。由此推論，肺痹湯多次給藥可以提高復方有效成分在體內暴露量，所以在臨床上肺痹湯治療間質性肺疾病適宜長期服用，從而增加有效成分在體內的蓄積，更好地發揮治療作用。