基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析刺果番荔枝葉的化學成分

肖治均 楊欣欣 梅矩銘 王梓軒 李婭琦 劉春生 雷海民 徐擁軍 陳嚇第 王學勇 馬長華

腫瘤是一種多見疾病，其發病率與死亡率在世界范圍內迅速增長[1]。刺果番荔枝作為一種天然的抗癌藥物，俗稱作“癌癥殺手”，能導致多種腫瘤細胞發生凋亡，已經證實其對肝癌、前列腺癌、乳腺癌和皮膚癌有一定的抑制作用[2-5]。刺果番荔枝AmronamuricataL.又稱紅毛榴蓮，為番荔枝科，番荔枝屬(Annoaceae)中的一個栽培種，原產于南美洲。目前，在中國海南、云南、廣東和廣西等地均有引種栽培[6]。現代藥理學研究表明，番荔枝內酯類和生物堿類是該植物的主要化學成分，具有抗腫瘤、抗瘧和抗寄生蟲的活性[7]。自20世紀80年代以來，人們發現該植物的種子和葉片具有抗癌和抑菌作用，引起了研究者的廣泛關注，在南美和非洲等地，該植物已被用于治療癌癥，具有發展為天然抗癌藥的潛力[8-9]。

天然植物化學成分復雜，利用傳統的提取、分離、純化并結合NMR技術研究天然植物中的化學成分，不僅方法繁瑣，且耗時費力[10]。近年來，液相色譜-質譜聯用( LC-MS )技術已成為天然植物中化學成分快速分離與鑒定的強有力手段[11-13]。LTQ-Orbitrap-MS是近年來發展起來的一項新質譜聯用技術，其綜合了LTQ的多級質譜功能以及Orbitrap的高分辨能力，可在較短時間內同時實現對母、子離子的高分辨采集和多級質譜碎裂，顯著提高了復雜體系中化學成分的快速鑒別與分析能力[14-15]。目前，對刺果番荔枝中化學成分的研究僅限于傳統提取分離手段結合半制備色譜法等，且多集中于種子和根部[16-20]，未見LC-MS法表征刺果番荔枝葉化學成分的報道。

本研究擬利用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術對刺果番荔枝葉中多種化學成分進行快速準確識別，通過查閱文獻，總結各類化合物的裂解規律，建立各類化合物的識別方法，以期為刺果番荔枝葉的提取分離與藥效物質基礎的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

LTQ-Orbitrap XL線性離子阱-串聯靜電軌道場質譜儀，配有熱電噴霧離子源(HESI)，Xcalibur 2.1 工作站(美國Thermo Fisher Scientific公司)，DFT-50A-型粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)，BS110S 1/1 萬天平(德國Sartorius儀器有限公司)，KQ-300DB型數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥材與試劑

刺果番荔枝葉采于厄瓜多爾瓜亞基爾市，經北京中醫藥大學中藥學院劉春生教授鑒定為番荔枝科，番荔枝屬刺果番荔枝AmronamuricataL.的干燥葉片。乙腈(質譜純，Fisher公司)，甲酸(質譜純，德國 Merk公司)，超純水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)，其他試劑均為市售分析純(北京化工廠)。

1.3 供試品溶液的制備

取適量干燥刺果番荔枝葉，粉碎機粉碎，過 60 目篩，精密稱定粉末1.0 g置100 mL錐形瓶中，精密加入 95% 乙醇50 mL，超聲提取( 功率300 W，頻率40 kHz ) 30 min，取出，冷卻至室溫，取上清液經0.22 μm濾膜濾過，即得刺果番荔枝葉樣品溶液。

1.4 色譜條件

Acquity UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相0.1% 甲酸水( A )-乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～9 min (5%～60% B)，9～12 min (60% ～ 70% B)，12～28 min (70%～90% B)，28～29 min (90%～5% B)，29～33 min (5%～5% B)；流速為0.3 mL/min；進樣量2 μL；進樣室溫度4 ℃；柱溫 30 ℃。

1.5 質譜條件

LTQ-Orbitrap XL線性離子阱-串聯靜電軌道場質譜儀，HESI 電噴霧離子源，正負離子檢出模式，離子源溫度 350 ℃，電離源電壓 4 KV，毛細管電壓：35 V，管透鏡電壓：110 V，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣(純度>99.99%)，鞘氣流速 40 arb，輔助氣流速：20 arb；激活能量單位：0.25 q；激活時間：30 ms；歸一化碰撞能量：35%；傅里葉高分辨掃描范圍m/z100～1500 Da；樣品采用傅里葉變換高分辨全掃方式(FT，Full scan，Resolution 30000)，二級和三級質譜采用數據依賴性(data-dependent acquisistion) ddMS2和 ddMS3掃描，選取上一級豐度最高的3個色譜峰進行碰撞誘導解離( CID )碎片掃描。

1.6 化學成分的鑒定

色譜及質譜條件下，分別測定正、負離子模式下刺果番荔枝葉的總離子流圖，使用Xcalibur軟件( Thermo Fisher Scientific )對質譜數據進行分析，通過一級高分辨率質譜信息推導其可能的分子式，質譜偏差范圍 δ ≤ 5×10-6。由Reaxys數據庫檢索番荔枝屬化學成分相關信息，包括化合物名稱、分子式和結構式。根據各化合物的特征裂解規律分析鑒別化合物，并結合相關文獻數據報道對鑒別的化學成分做進一步確認。

2 結果

在質譜正、負離子模式下共推測鑒定出 45 個化合物，包括16個生物堿類，14個番荔枝內酯類，8個黃酮類和7個其他類化合物。刺果番荔枝葉在正負離子模式下質譜的BPI圖見圖 1，45 個化合物的詳細數據見表 1。

注： ( A )正離子；( B )負離子圖1 刺果番荔枝葉 UPLC-LTQ-Orbitrap-MS質譜基峰離子流圖

表1 刺果番荔枝葉化學成分質譜鑒定結果

續表

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2.1 刺果番荔枝葉中生物堿類成分的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析

在刺果番荔枝葉質譜的正離子模式下共檢測出16個生物堿類化合物，其中包括芐基異喹啉類8個( 化合物5、7、11、13、18、19、20和21 )，阿樸啡類5個( 化合物6、8、9、22和23 )和四氫原小檗堿類生物堿2個( 化合物28和29 )。

2.1.1 芐基異喹啉類生物堿的鑒定 芐基異喹啉類生物堿的質譜特征是C1的芐基裂解，生成四氫異喹啉離子和互補的芐基離子，裂解主要受氮原子支配，主要裂解方式是以氮原子為中心的 α 裂解等，且多涉及骨架的裂解[21]。利用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術結合化合物的裂解規律以及文獻報道從刺果番荔枝葉中鑒定的芐基異喹啉類生物堿有化合物5去甲烏藥堿[22]、7烏藥堿、11和20網狀番荔枝堿[23]與其異構體、13和21 N-甲基烏藥堿與其異構體、18蓮心季銨堿和19杏黃罌粟堿。

2.1.2 阿樸啡類生物堿的鑒定 阿樸啡類生物堿主要的裂解行為表現在B環上的逆狄爾斯-阿德爾(RDA)裂解，失去CH2= N-R基團，R基團可為H和CH3，即得到[M+H-29]+和[M+H-43]+離子，用以區分N上是否含有甲基[24]。從刺果番荔枝葉中鑒定的阿樸啡類生物堿有化合物6新木姜子堿、8 Apoglaziovine、9異紫堇塊莖堿、22 Lirinidine和23降月桂堿。

2.1.3 四氫原小檗堿類生物堿 四氫原小檗堿類的基本骨架是苯二亞甲基與四氫異喹啉的兩處連接，構成一個中間有兩個脂肪環的四環系統，C環發生RDA裂解，生成兩個互補的碎片離子。化合物28紫堇達明堿和29番荔枝寧是從刺果番荔枝葉中鑒定出的四氫原小檗堿類生物堿。

2.1.4 其他類生物堿的鑒定 除上述三種生物堿類化合物，從刺果番荔枝葉中還鑒定出一個其他類生物堿，化合物N-p-香豆酰胺 (N-p-Coumaroyltyramine)，質譜上的分子離子峰m/z284.12903[M+H]+，推測其可能的分子式為 C17H18NO3，質量偏差為0.910×10-6，形成m/z146.97[M+H-C8H11NO]+的基峰，經高分辨精確分子量和碎片信息推測化合物24為N-p-香豆酰胺(N-p-Coumaroyltyramine)。

2.2 刺果番荔枝葉中黃酮類成分的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析

在刺果番荔枝葉質譜負離子模式下，鑒定出7個黃酮類化合物( 化合物12蘆丁[25]、14金絲桃苷、15山奈酚3-O-蕓香糖苷、16水仙苷、17紫云英苷、26槲皮素[26]和27山奈酚 )，此黃酮類化合物在質譜上表現出的裂解規律多以糖基的丟失和苷元發生特征裂解丟失H2O、-CH3、-CO以及-OCH3等基本官能團和發生RDA裂解。

2.3 刺果番荔枝葉中番荔枝內酯類成分的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析

番荔枝內酯類化合物( Annonaceous acetogenins ACGs)，分子中除了1個五元內酯環的端基外，鏈中還有1至2個四氫呋喃環，另外還含有羥基，這類化合物的質譜碎片離子是由于四氫呋喃環或羥基引起的 α-裂解所致，所得離子還能連續失水或由內酯環失去一氧化碳[27]。正離子模式下鑒定出14個番荔枝內酯類化合物( 化合物31 Annoglaxin、32和34 Murihexocin B與其異構體、35、36和37 Annomonicine與其異構體、38番荔枝素A、39和42 Neoannonine與其異構體、40 Corepoxylone、41異番荔枝素、43 Annonacinone、44番荔枝寧-VI和45 Corepoxylone)。

2.4 其他類成分的鑒定

通過刺果番荔枝葉的質譜數據，還鑒定出除生物堿、黃酮和番荔枝內酯以外的化合物，如化合物1蔗糖[28]、2奎尼酸、3咖啡酸和4綠原酸。

3 討論

本文應用 UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 技術對刺果番荔枝葉中的化學成分進行表征分析，通過分析高分辨精確分子量、色譜保留時間和多級質譜碎片離子等信息，并結合相關文獻報道，共鑒定出45個化合物，包括生物堿類、番荔枝內酯類、黃酮類和其他類化合物，其中以生物堿類和番荔枝內酯類化合物居多，與文獻報道的刺果番荔枝發揮主要的抗癌類成分一致。其中去甲烏藥堿和番荔枝寧據現代藥理研究表明具有鎮靜、強心和抗瘧活性[29-30]；番荔枝內酯類化合物除具有神經毒性和殺蟲效果外，還具有良好的抗腫瘤和細胞毒性作用[31]，是發揮抗癌作用的主要藥效物質。刺果番荔枝葉中的化學成分豐富，生物活性多樣，可對其發揮藥效的作用機制深入研究。本研究為刺果番荔枝葉中化學成分的定性研究提供了一種快速準確的鑒定方法，為刺果番荔枝葉的提取分離以及藥效物質基礎研究提供了進一步的參考。但本實驗只是通過一級高分辨的精確分子量、二級特征碎片信息和相關文獻數據報道推斷化合物的可能裂解途徑，缺少化學標準品的比對，其準確性有待進一步驗證，尤其是同分異構體的存在。