間充質(zhì)干細胞來源外泌體對視網(wǎng)膜新生血管影響的研究進展

楊曉英，徐國興

0引言

視網(wǎng)膜新生血管疾病屬于全球范圍內(nèi)視力喪失的常見疾病[1]，目前視網(wǎng)膜血管疾病藥物治療的最新進展包括玻璃體內(nèi)應用緩釋類固醇治療黃斑水腫和眼內(nèi)注射血管內(nèi)皮生長因子抗體及干細胞移植等，以消退眼內(nèi)新生血管形成。干細胞由于制備方便、可高效擴增、具有免疫調(diào)節(jié)和組織修復能力等優(yōu)點，逐漸成為一線臨床治療的潛在方案。干細胞治療盡管潛力極大，但也存在較多問題，如移植細胞的低生存力、先天異質(zhì)性等。最近有報道稱，來源于間充質(zhì)干細胞(MSCs)的外泌體具有與MSCs相似的功能，外泌體包裹的抗炎藥物可以從鼻孔運輸?shù)酱竽X以治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥性疾病[2]。以類似的方式，眼外注射外泌體使它們從眼球下空間快速遞送到脈絡膜和視網(wǎng)膜中。因此，眼外注射外泌體成為一種安全的給藥途徑，為治療視網(wǎng)膜新生血管疾病提供新的治療思路[3]。

1 MSCs衍生的外泌體

1.1 MSCs衍生的外泌體概述MSCs是一群自我更新和分化的多能前體細胞，在特定條件下具有分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞、肌細胞等的能力[4]。MSCs可以常規(guī)從自體或同種異體組織中獲得[5]。MSCs不僅可以通過自我增殖和分化取代受損組織，還可以通過旁分泌調(diào)節(jié)作用，作為重要的微環(huán)境調(diào)節(jié)劑來改變受損組織的微環(huán)境。由于獲得方便，免疫原性低，無倫理爭議和可分泌營養(yǎng)因子等優(yōu)點，被認為是治療和移植的重要資源[6]。盡管具有如此潛在的治療應用前景，但是仍面臨一些技術障礙，如移植細胞的低生存力，先天異質(zhì)性，與供體衰老有關的不明因素和潛在的致瘤性等[7]。目前，多項研究報道，來源于MSCs的外泌體具有與MSCs相似的功能，包括修復受損組織，抑制炎癥反應和調(diào)節(jié)免疫反應等。外泌體是一種可從許多不同類型的細胞分離的直徑約100(30～120)nm的細胞外囊泡(EV)[8]。EV是由脂質(zhì)雙層包圍的天然納米顆粒，受微環(huán)境影響而釋放。EV將其膜信號或親本細胞的內(nèi)部內(nèi)容物(包括核酸、脂質(zhì)、線粒體和蛋白質(zhì))傳遞到靶細胞中，從而導致靶細胞發(fā)生的生理變化[9-10]。與MSCs相比，間充質(zhì)干細胞衍生的外泌體(MSCs-Exo)具有穩(wěn)定性好，易保存，無免疫原性，易于獲取，轉化方便等優(yōu)點，由于尺寸較小，外泌體可以很容易地穿過生物屏障并進入靶器官[8]。因此，它為許多疾病的治療提供了一種新方法。

1.2 MSCs衍生的外泌體來源和組成

1.2.1 MSCs衍生的外泌體的來源外泌體最初是在1983年發(fā)現(xiàn)的，以前認為它只是浪費細胞。然而，研究人員發(fā)現(xiàn)，這種微小的膜囊泡中存在細胞的各種復雜成分。例如，一些具有特定功能的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組分分布在囊泡[11-12]的表面上。外泌體中的蛋白質(zhì)可分為兩類：第一種是廣譜蛋白質(zhì)，其與外泌體的生物起源和功能相關，例如抗原結合蛋白。第二種是特異性蛋白質(zhì)，其呈現(xiàn)特定的細胞功能。具有不同來源的外泌體的生理功能是多種多樣的。外泌體將重要的生物分子(如受體和配體)轉運到靶細胞，并反過來觸發(fā)這些生物分子的釋放。外泌體作為微環(huán)境的重要組成部分，是由大多數(shù)細胞分泌的膜囊泡，直徑為40～150nm。在各種活細胞和細胞膜的多囊體融合后，外泌體以胞吐作用的形式釋放到細胞外環(huán)境中[13-15]。

1.2.2 MSCs衍生的外泌體的組成研究表明，不同組織來源的MSCs有助于消除炎癥反應和組織修復和再生，主要是通過細胞外囊泡依賴性旁分泌方式。細胞外囊泡可以基于直徑細分為3類：直徑在40～100nm之間的外泌體，直徑在100～1000nm之間的微泡和直徑在500～1000nm之間的凋亡小體。在許多情況下，“細胞外囊泡”被稱為外泌體和微泡的組合。外泌體通過內(nèi)體膜的向內(nèi)出芽產(chǎn)生的小膜囊泡(30～100nm)通過將復雜的生物信息[包括mRNA，微小RNA(miRNA)和可溶性蛋白質(zhì)]轉移到這些靶細胞中來調(diào)節(jié)受體細胞的功能[16]。載于外泌體或微泡中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核苷酸和其他成分可以被運輸?shù)绞荏w細胞并影響各種細胞內(nèi)信號傳導[17]。MSCs-Exo保留了其親本MSCs的一些特征，如免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)神經(jīng)突向外生長，促進血管生成[18]，以及修復受損組織的能力。

2 MSCs衍生的外泌體的功能

2.1修復受損組織先前的研究表明，不同來源的MSCs，包括人臍帶血、骨髓、胚胎和胎膜等，可用于組織修復。Ding等[19]研究去鐵胺刺激人骨髓間充質(zhì)干細胞衍生的外泌體通過促進血管新生而促進創(chuàng)面愈合的機制，研究表明MSCs衍生的外泌體通過PI3K/AKT途徑誘導血管化，促進糖尿病皮膚創(chuàng)傷動物模型的皮膚創(chuàng)傷恢復。去鐵胺可能導致外泌體被觸發(fā)，以便在無細胞治療應用中顯示出增強的血管生成潛能。Kim等[20]研究從人臍血間充質(zhì)干細胞衍生的外泌體刺激人皮膚的再生機制，發(fā)現(xiàn)人臍血間充質(zhì)干細胞衍生的外泌體具有多種與皮膚修復有關的生長因子。經(jīng)局部處理后，能促進人皮膚Ⅰ型膠原和彈性蛋白的產(chǎn)生，降低人皮膚中MMP-1的生成。體外結果顯示，人臍血間充質(zhì)干細胞衍生的外泌體集成在人真皮成纖維細胞(HDFS)中，從而促進HDFS細胞遷移和膠原合成，對人類皮膚的創(chuàng)面修復有重要意義。

2.2抑制炎癥反應MSCs衍生的外泌體不僅可促進血管生成，修復受損相關組織，還具有抗炎作用。Sun等[21]研究人臍帶血間充質(zhì)干細胞衍生的外泌體通過減輕炎癥反應促進脊髓損傷小鼠功能的恢復，通過制備了人臍帶血間充質(zhì)干細胞衍生的外泌體，對脊髓損傷小鼠行尾靜脈注射。結果表明，來源于hucmsc的外泌體能有效觸發(fā)巨噬細胞從m1向m2表型的極化，并顯著降低促炎細胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、g-csf、mcp-1和mip-1α水平，同時增加抗炎細胞因子水平，對脊髓損傷后的功能恢復有明顯的促進作用。

2.3調(diào)節(jié)免疫反應外泌體通過使用多個來向所有類型的免疫細胞明顯地向T淋巴細胞傳遞消極信息機制。例如，已經(jīng)顯示來自MSCs和腫瘤來源的外泌體可以抑制淋巴細胞的增殖。以前顯示由乳腺癌釋放的外泌體可直接抑制CD4+和CD8+T淋巴細胞[22]。類似地，來自人類脂肪組織的MSCs衍生的外泌體證明了這一點有可能減少T細胞增殖。另外由外泌體實施的機制是通過誘導免疫效應細胞中的細胞凋亡。微泡或外泌體已發(fā)現(xiàn)在其表面上表達FASL和TRAIL以包括淋巴細胞為靶向[23-25]。抑制炎性細胞因子如IFN-γ和IL-17的產(chǎn)生是MSCs衍生的外泌體用于抑制免疫應答的另一種機制[26]。

2.4外泌體在多種疾病中發(fā)揮著至關重要的作用Ono等[27]發(fā)現(xiàn)miR-23b在BM2細胞處理后上調(diào)MSCs-Exo，從而通過抑制靶基因MARCKS誘導休眠。抑制的MARCKS最終促進了乳腺癌細胞的休眠。Huang等[28]表明MSCs-Exo參與心臟和血管，發(fā)揮抗凋亡，心臟再生，抗心臟重塑，抗炎，新血管形成和抗血管重塑的作用。最近對在低氧，無血清條件下培養(yǎng)的人MSCs衍生的外泌體的全面蛋白質(zhì)組學分析顯示，這些外泌體表達涉及血管生成的多種因子，包括與核因子κB(NFκB)，血小板衍生生長因子相關的信號蛋白表皮生長因子(EGF)和成纖維細胞生長因子(FGF)等。此外，它被認為是MSCs移植治療的一種新的潛在分子機制[29]。總之，外泌體和多種疾病之間存在密切關系。然而，視網(wǎng)膜新生血管疾病在外泌體的研究則相對有限。

2.5外泌體在視網(wǎng)膜新生血管疾病的最新進展Hajrasouliha等[3]研究來自視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞的外泌體抑制激光誘導的脈絡膜新生血管的抗血管生成的機制，通過構建激光誘導的CNV模型，將外泌體注射入小鼠玻璃體腔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)來自視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞的外泌體含有多種抑制激光誘導的脈絡膜新生血管形成的抗血管生成成分。說明視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞外泌體具有治療脈絡膜新生血管的臨床應用潛力，可用作幾種疾病的輔助療法，包括滲出性年齡相關性黃斑變性(ARMD)，增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病和與腫瘤轉移相關的血管生成等。He等[8]通過從人臍帶血間充質(zhì)干細胞中成功分離外泌體，與RPE細胞共培養(yǎng)，并構建暴露于藍光下激光誘發(fā)視網(wǎng)膜損傷小鼠模型，于小鼠玻璃體內(nèi)注射不同劑量外泌體，觀察并比較它們在激光誘發(fā)視網(wǎng)膜損傷小鼠模型中的作用，發(fā)現(xiàn)MSCs衍生的外泌體通過下調(diào)VEGF-A改善RPE細胞中的藍光刺激和激光誘導的視網(wǎng)膜損傷。推測MSCs-Exo可能是玻璃體內(nèi)注射的最佳候選者，可能克服潛在干細胞移植治療相關的障礙和風險，如長期病理分化、保存不良等。Moisseiev等[30]通過成功構建OIR模型，于玻璃體腔內(nèi)注射外泌體，發(fā)現(xiàn)通過低氧、無血清條件下從間充質(zhì)干細胞分離的外泌體注射入OIR小鼠眼內(nèi)能較好耐受，對視網(wǎng)膜缺血有保護作用，且無免疫及炎癥反應發(fā)生。外泌體治療后視網(wǎng)膜缺血程度和新生血管發(fā)展減少。說明外泌體可作為一種新的非細胞治療方式。

3展望

MSCs-Exo具有免疫調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突向外生長，促進血管生成以及修復受損組織等能力，且更加安全穩(wěn)定，在視網(wǎng)膜新生血管疾病應用方面具有廣闊前景。但外泌體的研究尚處于實驗階段，仍需在與人眼更加相似的大型動物眼內(nèi)進行模擬，從而檢測安全性及更好地理解MSCs-Exo作用，并且能夠應用于臨床之前時還需研究遠期劑量問題。相信隨著研究的深入，外泌體療法會為視網(wǎng)膜新生血管疾病患者提供新的希望。