糖基化終末產物在青光眼中的研究進展

韓明月，董洪亮，于金璐，王 強

0引言

青光眼是一種威脅和損害視覺通路及視神經的疾病，最終導致視覺功能不可逆損害，主要與病理性眼壓升高有關[1]。視神經退行性病變是青光眼最核心的問題，無論何種類型青光眼，都具有這一共同病理損害。我國青光眼患病率居世界首位且患者大多為老年人，大部分患者首診時已經是視覺損傷中晚期，預后較差，因此廣泛、深入的青光眼防治尤為重要。

糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)是蛋白質、脂質或核酸等大分子物質與葡萄糖或者其他還原糖在非酶條件下生成的穩定共價加成物，是非酶糖基化反應(米拉德反應)的終末產物，這種反應可以發生在所有細胞中(glucose-meditate protein glycation contribution)(圖1[2])。AGEs在體內累積并通過激活相關信號通路等誘發氧化應激反應，造成一系列年齡相關性疾病及神經退行性病變，如阿爾茨海默病、帕金森病[2]。AGEs在視網膜等眼組織中累積，通過直接細胞毒性和與受體結合產生一系列生物學反應等對組織、細胞產生損傷，導致青光眼的發生及發展[3]。現就AGEs在青光眼中的作用研究進展進行綜述。

1 AGEs來源及生物學特性

AGEs有兩種重要的來源：內源性和外源性[4-5]。內源性來源主要是體內葡萄糖及某些高活性糖分子(果糖、糖代謝中間產物如6-磷酸葡萄糖、3-磷酸甘油醛等)和蛋白質、脂質等大分子物質通過非酶糖基化反應產生。還原糖的醛基和大分子物質末端的還原性氨基發生米拉德反應生成不穩定的希夫堿，這一過程反應迅速且高度可逆；數天后，不穩定的希夫堿發生葡糖胺重排反應(Amadori重排)，這一過程緩慢且可逆，但總體朝向Amadori重排產物方向，米拉德反應和Amadori重排產生可逆的早期糖基化產物(Amadori重排產物、希夫堿、米拉德產物)，這些中間產物數量與葡萄糖等還原糖濃度有關，當葡萄糖被清除時，中間產物濃度也會下降；隨后中間產物再經脫水等一系列反應生成羰基化合物，再與蛋白質自由氨基反應生成不可逆的晚期AGEs(羥甲基賴氨酸、羥乙基賴氨酸等)。此外，部分還原糖通過糖酵解途徑產生活性α-二羰基(乙二醛、丙酮醛等)，經Amadori重排后生成不可逆的晚期AGEs[6-7]。以上反應均不需要酶的催化，為非酶糖基化反應。

圖1 AGEs的形成和保護調節系統 AGEs可以由高濃度的血糖通過米拉德反應緩慢地形成，也可以通過與α-二羰基反應更快地形成。反應性二羰基包括甲基乙二醛(MGO)、乙二醛或3-deoxyglucosane (3 DG)。AGEs包括羧甲基賴氨酸(CML)、羧乙基賴氨酸(CEL)、甲基乙二醛衍生物氫咪唑酮(MGH1)等。解毒途徑如乙二醛酶途徑和蛋白質量控制系統組成了保護性抗AGEs機制(綠色高亮部分)，這種蛋白質量控制系統包括泛素-蛋白酶體系統(UPS)和自噬。

圖2 眼組織中AGEs的病理生理學 AGEs可以通過(1)細胞外累積并改變細胞外基質的生化特性；(2)與質膜受體結合，觸發特定轉錄因子的核易位；(3)細胞內形成的AGEs誘導蛋白交聯，改變蛋白構象結構，影響蛋白活性。細胞內聚集物水平的升高被認為具有細胞毒性。

外源性來源是食物中的糖、蛋白質、脂肪等通過高溫過度烹飪或者過度加工發生了非酶糖基化反應，產生了大量AGEs。這些AGEs進入人體后經消化吸收進入血液循環[8-9]，經代謝后僅有10%保留下來，其余通過尿液在48h內排出[6]。

AGEs在生物體內通過以下幾種機制發揮作用(圖2[2])：(1)細胞外基質中過多沉積的AGEs和穩定的長壽蛋白交聯，減少組織彈性；(2)AGEs直接糖化細胞內蛋白質和脂質等損害細胞功能；(3)AGEs直接調節相關因子表達，或者和相應細胞受體結合來激活相關細胞信號通路，改變相應的基因表達。AGEs受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)是AGE受體類型之一，存在于巨噬細胞、單核細胞、平滑肌細胞等多種細胞中，AGEs與RAGE結合后誘導p21和MAPK通路活化，繼而引起NF-κB遷移及目標基因轉錄，如生長因子、黏附分子(內皮因子-1、VCAM-1等)，還有促炎因子(IL-6、IL-1、TNG-α)，激活細胞內氧化應激信號通路，產生活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)[10-11]。氧化應激產物ROS反過來上調RAGE表達，兩者相互作用，加劇氧化應激反應，最終導致組織或者細胞的結構或者功能損傷。

2 AGEs與青光眼發病的關系

2.1 AGEs在青光眼患者中的分布AGEs在青光眼患者眼組織中表現出過多沉積[12]。Hondur等[13]通過對比同等年齡青光眼組和非青光眼組患者的房水和血清發現，青光眼組患者血清和房水中AGEs含量均明顯高于非青光眼組患者，而且房水中含量高于血清中含量。對比年輕人群和老年人群血清及房水，發現AGEs在老年人群中的累積增加，這與青光眼好發于老年人群符合[1]。既往研究[14-15]通過免疫組織化學等方法檢測青光眼患者眼中AGEs含量，發現異常AGEs沉積主要在篩板及視乳頭周圍血管、視網膜中。一些神經膠質細胞、視網膜神經節細胞和軸突細胞內也檢測出AGEs免疫標記。然而，眼組織中增加的AGEs免疫標記主要存在于細胞外。RAGE主要在視網膜神經膠質細胞中被發現，尤其是Müller細胞，在視網膜神經節細胞中也發現了相應免疫標記[16-17]。由以上結論可知，AGEs在青光眼患者中異常沉積，可能參與了青光眼的發生及發展過程。

2.2 AGEs在青光眼中的作用機制AGEs廣泛存在于篩板、視乳頭及周圍視網膜、視神經節細胞等組織細胞中，并通過以下機制參與了青光眼發生、發展的病理過程[3-4]。(1)還原糖與蛋白質等大分子物質發生非酶糖基化反應后，形成不可溶解的、能抵抗蛋白酶的非降解聚合物。這些AGEs聚集在篩板上導致篩板硬度增加，眼壓作用于篩板直接對視神經纖維壓迫增加，阻礙了視網膜神經節細胞軸漿流運轉代謝和腦源性神經營養因子的獲取，最終導致青光眼的發生[1]。而且在神經元中，這種非降解聚合物可以直接干預軸漿運輸和細胞內蛋白運輸，增加青光眼發病的可能性。另外，增加的AGEs還可以沉積在內質網中[18-19]，內質網是一些蛋白質折疊的場所，AGEs的沉積導致非折疊蛋白質增加，非折疊蛋白質反應的活化代表了可選擇的NF-κB活化和細胞凋亡啟動，最終導致相關細胞的凋亡。(2)AGEs通過結合到特定受體上來調節細胞功能。AGEs受體是免疫球蛋白超家族多配基信號轉導受體，主要存在于單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞、周細胞、小神經膠質細胞和星形膠質細胞中。AGEs與受體結合后誘導了p21和MAPK通路活化，緊接著引起NF-κB遷移及目標基因轉錄，包括生長因子、黏附因子、促炎因子等，有證據表明這些炎癥過程一旦啟動，就會終止于AGEs受體活化和炎癥因子產生的惡性循環中。而且，AGEs與受體結合后上調相關配基，維持細胞活化并且促進活性氧產物產生；增加的活性氧產物已被報道通過活化NADPH來上調AGEs與受體結合，兩者相互促進，最終導致組織細胞損傷，誘發或者加重青光眼病理損傷。張敏等[11]使用AGE-BSA干預體外培養牛眼小梁細胞，發現AGE-BSA可以明顯提高小梁細胞內ROS水平，且隨著AGE-BSA干預濃度的增加和時間的延長，小梁細胞凋亡率也隨之上升。另外，AGEs誘導的細胞活化引起血管黏附因子和生長因子等表達增加，誘導增殖分化因子釋放，比如轉化生長因子-α和白細胞介素-6，促進了細胞的活化、增殖、趨化性和血管生成，增加了炎性反應的發生，這些都參與了青光眼的發生和發展。(3)細胞內形成的AGEs誘導蛋白交聯，改變蛋白構象結構，影響蛋白活性，對細胞產生直接毒性作用。可見AGEs通過上述機制，對小梁組織、視神經篩板、視網膜等組織造成影響，促進青光眼的發生發展。

3 AGEs與青光眼標志物關系

青光眼相關的分子標志物可以提高疾病的早期臨床檢出率，預測青光眼患者預后，并且監測治療效果。隨著青光眼患者視網膜和視乳頭組織中氧化應激反應增加的證據逐漸被發現[3-4,20-21]，Hondur等[13]認為氧化編輯后的蛋白質或者氧化應激終末產物可以作為青光眼標志物，通過收集了經嚴格篩選的96例患青光眼受試者和64例未患青光眼受試者的血液和房水樣本，通過Elisa來檢測樣本中蛋白質羰基及AGEs含量。經對比患青光眼受試者血液和房水中蛋白羰基及AGEs水平大幅度升高，并且兩者在房水中的增加比血液中更明顯，青光眼受試者房水和血液中蛋白質羰基含量分別是未患青光眼受試者的2.6倍和1.9倍，AGEs分別為3.1倍和1.9倍。雖然通過檢測AGEs含量來篩查青光眼是一種很好的辦法，但房水樣本獲取較困難，多是患者行白內障超聲乳化摘除術時獲取，所以該方法應用到臨床實踐中仍需進一步改進。

Meerwaldt等[22]認為AGEs累積可以通過非侵入性方法檢測皮膚自發熒光來評估。血液或者尿液中的AGEs不能反應它們在組織中的水平；皮膚自發熒光，特別是半衰期為15a的皮膚膠原纖維，可以評估組織中AGEs的累積，所以皮膚自發熒光被認為是反應累積代謝壓力更好的指標。Schweitzer等[23]使用皮膚自發熒光評估了AGEs累積與開角型青光眼的關系。他們認為高水平的皮膚自發熒光作為代謝記憶的長期標志物，和吸煙一起成為患青光眼風險增加的相關獨立因素[24-25]。作為氧化應激的標志物，AGEs在眼組織中的長期累積在青光眼慢性視神經病中起到重要作用。皮膚自發熒光檢測是一種無創操作，作為普查方法更易被接受，可以大大提高青光眼早期篩查率，及早治療，減少青光眼進展帶來的視功能損害。

4 AGEs與青光眼的治療

AGEs通過多種機制導致青光眼的發生，相應的阻斷AGEs的形成、破壞已經交聯的AGEs、阻止下游反應啟動或者抑制其直接細胞毒性作用成為了當前研究青光眼治療的熱點。Kiland等[14]在老年恒河猴玻璃體腔內注射了抵抗AGEs交聯形成的藥物4,5-二甲基-3-(2-氧代-2-苯基乙基)噻唑鎓氯化物，6mo后通過電鏡和免疫組化等方法觀察眼球前后節變化。通過觀察發現，實驗組AGEs在視乳頭中表達下降，在前節改變不明顯。此外，對比對照組，實驗組靜脈注射匹羅卡品后房水流出系數明顯增加，表明4,5-二甲基-3-(2-氧代-2-苯基乙基)噻唑鎓氯化物對青光眼有一定的治療效果。在青光眼視乳頭篩板和血管中，AGEs累積減弱了篩板軸索支持功能，損傷微循環，因此導致組織對壓力性軸索損傷的敏感性增加；AGEs與相應受體結合及對細胞直接毒性作用，這些最終導致青光眼的發生。4,5-二甲基-3-(2-氧代-2-苯基乙基)噻唑鎓氯化物的干預減少了眼組織中AGEs的表達，減少了AGEs帶來的一系列病理損傷，對降低青光眼發病率有效。但是，直接將4,5-二甲基-3-(2-氧代-2-苯基乙基)噻唑鎓氯化物注射到眼中來治療青光眼目前尚不可行，仍需要進一步研究改進。

寧夏枸杞是一種富含枸杞多糖的傳統中藥，經歷了長期的抗衰老效果驗證。許多前瞻性研究發現，枸杞多糖對中樞神經系統的神經元有潛在神經保護作用[26-27]。Mi等[28]建造急性高眼壓動物模型，分別給予不同組動物含枸杞多糖飲食及普通飲食，觀察枸杞多糖對視網膜神經節細胞和血-視網膜屏障的神經保護作用。通過數據評估發現，枸杞多糖對高眼壓引起的神經缺血性損傷有保護作用，其保護機制與視網膜中下調的RAGE、內皮素-1、Aβ(1-42)和AGEs有關，并且枸杞多糖激活的信號通路也能抑制血管損傷和神經退行性病變。枸杞多糖還能下調AGEs表達，在非高眼壓對照組視網膜中，在血管周圍發現了AGE免疫反應陽性表達；在普通飲食干預的高眼壓組，視網膜神經節細胞層和內核層神經中AGEs表達呈強陽性，并且內叢狀層中的Müller細胞中AGEs表達與終足細胞有關，甚至其他視網膜層實質中分布也存在一些無形態彌漫性陽性信號；在枸杞多糖喂養的高眼壓組中，與普通飲食喂養的高眼壓對照組中，AGEs表達下調。但是，在終足細胞和Müller細胞中仍有一些強陽性信號。通過上文可以推論出，枸杞多糖可以嘗試應用到青光眼治療中。目前研究證明枸杞多糖可以抑制缺血性損傷導致的視網膜神經節細胞、視網膜神經元和血視網膜屏障的損傷，通過這種血管保護機制，枸杞多糖也可以是血管相關視網膜病變的潛在治療方案。

既往研究[29-32]認為限制飲食中過多的糖可以優化血糖水平，并且抑制AGEs的形成和有關眼部疾病的病理發展。最近，一些新的文獻一致認為低含糖量飲食是有益的[33]。同樣熱量的食物，低糖指數的食物能更緩慢地釋放葡萄糖到血液中。比如蔬菜和全麥食物消化吸收比較緩慢，并且能緩慢釋放葡萄糖到血液中，而白面包和精制糖很快就被消化吸收掉，并且迅速轉化成血糖吸收進入血液[2]。這些結論與前文所述非酶糖基化反應中間產物數量與體內還原糖數量成正相關相吻合，如果降低體內葡萄糖等還原糖濃度，中間產物數量也會隨之下降，AGEs的數量也會減少。

Stitt[34]認為在不可逆的AGEs形成之前，蛋白交聯過程需要緩慢的化學重排過程(Amadori重排)來創建反應性中間產物，所以Amadori產物形成是非酶糖基化反應的基礎。小親核酰肼復合物氨基胍是有效的AGEs介導交聯抑制物，重要的藥理學方案利用這種小親核酰肼復合物氨基胍來抑制上述重排反應，進而抑制AGEs的產生。破壞清除已經形成的AGEs也是一種治療方案。在糖尿病鼠模型中，AGEs定位在了血管基底膜和視網膜周細胞中。另外，AGEs受體信號轉導通路的闡明也可以提供細胞內治療方案[35-36]。這些研究成果表明，通過阻斷非酶糖基化中間產物轉化成不可逆產物的過程，可以減少AGEs產生，這為青光眼的治療提供了新的靶點。

5小結

青光眼是全球首位不可逆致盲疾病，在我國老年患者比重及青光眼絕對數居世界首位，AGEs作為一種非酶糖基化產物參與了多種全身疾病的發生。本文旨在綜述AGEs在青光眼發生發展中的作用，但AGEs發揮作用所觸發的具體信號通路目前還不清楚，仍需進一步討論研究。研究AGEs在青光眼發病機制中的作用能更好、更深入研究青光眼的病因，進而更好地預防及治療青光眼，保護視功能，提高生活質量。