AMD3100聯合G-CSF對2型糖尿病小鼠骨髓EPCs動員的培養

潘滿昌 林曉瑩 汪虹 冷敏

摘要：目的? 研究AMD3100聯合G-CSF對糖尿病骨髓內皮祖細胞的培養方法和生物學功能。方法? 選用6周齡健康雄鼠，將10只db/db小鼠設為db/db組，10只db/+小鼠設為db/+組。采用AMD3100與CSF聯合動員骨髓內皮祖細胞的方法，每只小鼠第1天注射AMD3100，后續連續注射5 d G-CSF，在第10天心臟采血制備EPCs。采用流式細胞儀檢測CD34+/CD133+/CD309+細胞的比例進行鑒定，鑒定成功的EPCs采用CCK-8法、Matrigel檢測細胞增殖及成管功能。采用PCR檢測細胞表面標志物：血管內皮生長因子（VEGF）、基質細胞衍生因子（SDF-1）、趨化因子受體4（CXCR4）基因表達情況。結果? ①從處理后的第3天開始，db/+組的OD450值較db/db組增高（P=0.05）;②0和48 h db/+組EPCs遷移面積分別為（204088.100±219.200）μm、 （144724.900±199.400）μm，大于db/db組的（200985.700±232.600）μm、（155075.300±213.100）μm（P<0.05）;③db/+組管腔形成數量為（29.330±1.764）個，多于db/db組的（24.000±2.082）個（P<0.05）。結論? 采用AMD3100聯合G-CSF動員2型糖尿病骨髓內皮祖細胞的方法成功從外周血中分離出EPCs，經體外培養發現2型糖尿病狀態下EPCs的增殖，遷移和成管等功能均受損。

關鍵詞：糖尿病;內皮祖細胞;聯合動員;移植

中圖分類號：R587.2;R-33? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.09.018

文章編號：1006-1959（2020）09-0057-06

Cultivation of Bone Marrow EPCs in Type 2 Diabetic Mice by AMD3100 and G-CSF

PAN Man-chang，LIN Xiao-ying，WANG Hong，LENG Min

（Department of Burns，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650000， Yunnan，China）

Abstract：Objective? To study the culture method and biological function of AMD3100 combined with G-CSF on diabetic bone marrow endothelial progenitor cells.Methods? Six-week-old healthy male rats were selected， 10 db/db mice were set as db/db group， and 10 db/+ mice were set as db/+ group. AMD3100 and CSF were used to mobilize bone marrow endothelial progenitor cells. Each mouse was injected with AMD3100 on the first day， followed by continuous injection of G-CSF for 5 d， and blood was collected on the 10th day to prepare EPCs. Flow cytometry was used to detect the ratio of CD34+/CD133+/CD309+ cells for identification. Successful EPCs were identified by CCK-8 method and Matrigel to detect cell proliferation and tube formation function. PCR was used to detect cell surface markers： vascular endothelial growth factor （VEGF）， stromal cell-derived factor （SDF-1）， and chemokine receptor 4 （CXCR4） gene expression.Results? ①From the third day after treatment， the OD450 value of the db/+ group was higher than that of the db/db group （P=0.05）; ②The migration area of EPCs in the 0 and 48 h db/+ groups was （204088.100±219.200） μm， （144724.900±199.400） μm，（200985.700±232.600） μm and （155075.300±213.100） μm （P<0.05） greater than the db/db group; ③The number of lumens formed in the db/+group was （29.330±1.764）， which was more than （24.000±2.082） in the db/db group （P<0.05）.Conclusion? In this experiment， AMD3100 and G-CSF were used to mobilize type 2 diabetic bone marrow endothelial progenitor cells. EPCs were successfully isolated from peripheral blood， and the proliferation， migration and tube formation of EPCs in type 2 diabetes were impaired by in vitro culture.

Key words：Diabetes;Endothelial progenitor cells;Joint mobilization;Transplantation

內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一類旁分泌各種血管生成因子參與內皮細胞功能的前體細胞。自1997年首次用磁珠法從成人外周血（PB）中分離出來，越來越多證據表明EPCs在病理生理下參與血管新生[1-3]。近年大量研究發現糖尿病狀態下EPCs被“拘留”于骨髓，致EPCs在外周血中數量減少、功能障礙及生物學活性降低[3，4]。因此，糖尿病EPCs的動員和體外分離培養成為研究的熱點。近年雖國內外很多有關EPCs報道[5-7]。但有關糖尿病EPCs聯合動員后外周血的分離培養研究報道尚少。既往研究發現糖尿病小鼠聯合動員第10天EPCs達到峰值。本研究以期通過聯合動員獲得糖尿病狀態下峰值的EPCs進行體外培養，獲得外周血EPCs分離培養方法，并通過細胞增殖、遷移和成管等情況，獲得EPCs體外培養的可靠來源，為深入研究糖尿病EPCs的功能障礙及以后臨床應用作參考。

1材料與方法

1.1實驗動物? 選取6 周齡SPF級db/db小鼠（25～30 g）和db/+小鼠（25～30 g）各10只雄性，db/db小鼠（糖尿病狀態） 是由C57小鼠（非糖尿病狀態）近親交配株常染色體隱性純合子遺傳衍化建立的2型糖尿病模型;db/+小鼠是由C57小鼠近親交配株常染色體雜合子遺傳衍化，無糖尿病癥狀。購自常州卡文斯實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（蘇）2016-0010。飼養于昆明泉港生物科技有限公司實驗動物中心飼養。

1.2主要的試劑和器材? AMD3100（Selleck 公司），rhG-CSF（齊魯制藥有限公司），0.9%氯化鈉注射液（上海百特醫療用品有限公司），肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司），PE/Cy7 anti-mouse CD34（abcam公司），APC anti-mouse CD133（abcam公司），PE anti-mouse CD309（Flk-1）（abcam公司），FAC SCantoⅡ流式儀（BD 公司）。

1.3實驗動物的分組及給藥方法? 選取6周齡健康雄鼠，將10只db/db小鼠設為db/db組，10只db/+小鼠設為db/+組。①db/db組動員方案為AMD3100+G-CSF：取10只db/db雄鼠，每只小鼠第1天注射AMD3100，后續連續注射5 d G-CSF，在第10天心臟采血制備EPCs。②db/+組：方法同db/db組。

1.4 AMD3100、G-CSF的注射劑量及配制? AMD3100和G-CSF動員EPCs皮下注射劑量參照國內外文獻：AMD3100 6 mg/（kg·d），G-CSF 100 mg/（kg·d）[8，9]。AMD3100 注射液配制方法如下：將AMD3100用PBS溶解，配制成濃度為50 mg/ml的溶液，并置于-20 ℃冰箱中貯存備用。而G-CSF可直接進行皮下注射，置于4 ℃冰箱中貯存備用。

1.5實驗方法

1.5.1小鼠外周血中EPCs的分離培養及收集? 采用1%的戊巴比妥將實驗小鼠麻醉，用2.5 ml含有肝素的注射器在胸前心尖搏動最明顯部位采血。然后采用密度梯度離心法提取單個核細胞，用PBS洗滌? ?2次，用含10%胎牛血清的內皮組細胞培養液重懸細胞，制成單細胞懸液分別接種到50 ml培養瓶中，37℃、5% CO2件下培養，每3 d換液1次，收集15 d細胞進行實驗。

1.5.2流式細胞術分析鑒定? 將細胞消化后用100 μl staining buffer重懸細胞，加入適量熒光標記表面抗體（PE/Cy7 anti-mouse CD34/APC anti-mouse CD133/PE anti-mouse CD309）染色，室溫避光染色30 min，然后洗滌細胞并使用Guava easyCyteTM流式細胞儀（Millipore，Billerica，USA）分析。

1.5.3 EPCs熒光雙染色鑒定? 取14 d的細胞在含Dil-acLDL（10 μg/ml）和FITC-UEA-1（10 μg/ml）的培養液中避光孵育，然后在激光共聚焦熒光顯微鏡進行觀察。

1.5.4 CCK-8細胞增殖實驗? 將細胞傳代在96孔板中，并處于對數生長期的各細胞消化、計數，均勻的鋪在96孔板（5000個/孔）。各孔加入10 μl CCK8試劑測定第1、3、5、7 天增殖情況，用酶標儀檢測OD450（optical density），單位：nm，繪制曲線。

1.5.5劃痕遷移實驗? 將EPCs制成單細胞懸液接種到6孔細胞培養板。EPCs接種48 h后用槍頭在單細胞層上輕輕劃一道傷痕。劃痕結束后用 PBS洗去除劃下細胞，拍照記錄0 、48 h對遷移面積拍照6張照片，并放大（×40），重復實驗3次。用軟件 Image J 計算細胞遷移率（Rn）：Rn（%）=24h遷移面積（0 h的劃痕面積-24 h的劃痕面積）與0 h面積的比值。

1.5.6管腔形成實驗? 在6孔板中加入100 μl基質膠，常溫離心20 min、 1500 r/min。在培養箱放置1 h，水化1 ml EPCs后將其緩慢預鋪基質膠孔內，8 h后在顯微鏡（×100）下拍照，每個孔隨機拍照8張，重復實驗3次，每孔平均值為管腔形成數目，統計分析。

1.6統計學處理? 使用 SPSS 17.0 統計軟件處理所有的數據，計量資料采用（x±s）表示，相同時間點不同組別之間采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，同一組別不同時間點之間的比較采用配對樣本t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1實驗動物的基本情況? 兩組小鼠在動員藥物皮下注射結束后，精神狀況良好，飲食、體重無明顯變化，均無意外死亡情況。

2.2細胞的形態學觀察? 分離的單個核細胞第2天細胞密集，較小的類圓形，呈懸浮狀態;第6天細胞在倒置顯微鏡觀察下活力比較旺盛，折光度好，細胞形態呈橢圓形或梭形，大小不等，可以見部分細胞已貼壁。傳至第15天細胞逐漸變大，伸出偽足樣突起，成紡錘體形細胞，形態此時較穩定，倒置顯微鏡下貼壁細胞透亮度增強，成單層細胞貼壁生長，見圖1。

2.3培養后EPCs鑒定

2.3.1流式細胞術分析? db/+小鼠外周血培養第15天 EPCs表達CD34、CD133及CD309，表達率分別為（72.23±3.84）%、（75.09±17.92）%及（80.98±0.53）%。db/db小鼠培養的第15 天EPCs表達CD34、CD133及CD309，表達率分別為（64.49±4.64）%、（85.19±18.39）%及（88.90±0.56）%，以上培養的細胞都是EPCs，見圖2。

2.3.2 EPCs熒光雙染色鑒定? 熒光顯微鏡觀察可見：PBMC提取培養15 d的EPC，細胞吞噬FITC-UEA-1示綠色熒光;細胞吞噬Dil-acLDL示紅色熒光;Merge為前兩張照片的融合圖，即EPCs是雙陽性染色攝取Dil-acLDL并結合FITC-UEA-1，呈現黃色熒光的細胞認為是分化狀態的EPCs，見圖3。

2.4 CCK-8細胞增殖實驗? 通過對db/db與db/+小鼠外周血培養15天的EPCs，在第1、3、5、7天的增殖情況顯示：db/+小鼠EPCs的增殖曲線較陡。比較各時間點各組OD450時發現，從處理后的第3天開始，db/+組的OD450值較db/db組均顯著增高（F=9.777，P=0.000），見表1。

2.5 劃痕遷移實驗? 將EPCs接種到6孔細胞培養板上培養0 h與48 h遷移距離，結果顯示：0 h 和48 h db/+組EPCs遷移面積分別為（204088.1±219.2）μm、（144724.9±199.4）μm，大于db/db組的（200985.7±232.6）μm、（155075.3±213.1）μm，差異有統計學意義（P<0.05），見圖4。

2.6管腔形成實驗? 將培養的EPCs 種植在 Matrigel 上8 h形成毛細血管樣網狀結構。db/+組管腔形成數量（29.330±1.764）個，大于db/db組的（24.000±2.082）個，差異有統計學意義（P<0.05），見圖5。

3討論

目前全球有4.25億糖尿病患者，每11位成人中就有1位罹患糖尿病，此外還有3.5億多糖尿病高危人群。預計到2045年，將會有近7億糖尿病患者。流行病學研究顯示，超過1/3的慢性難愈合創面患者是因糖尿病造成的，已經代替創傷成為造成慢性難愈合創面的首要原因[10]。利用EPCs趨化到受損血管部位，修復受損內皮細胞并增殖分化新的內皮細胞進而修復血管功能，近年來成為創面修復領域成為一個新策略。

EPCs可從骨髓、臍血、胚胎肝和外周血中（15∶10∶2∶1）分離培養獲得，而骨髓中所占比例最大[11]。成年后主要來源于骨髓，能夠替代損傷的血管內皮細胞，維持血管內皮的完整性[12]。外周血中EPCs主要來源于骨髓[13]。而糖尿病EPCs數量稀少，功能障礙及活性降低，成功培養糖尿病EPCs成為學者進一步研究的難點。而本課題組前期研究發現通過AMD3100聯合G-CSF可增加外周血中EPCs的數量，即EPCs在db/db小鼠外周血比例約占1.88%，在db/+小鼠外周血約占2.35%[9];而正常情況下EPCs僅占骨髓和外周血的0.01%[14]。該方法已經大幅度提高了外周血中EPCs的含量，且占比高于骨髓。但其相關功能和活性變化還未明確，因此，本研究對糖尿病小鼠動員后的EPCs進行分析。

本研究采用db/db小鼠是由C57小鼠近親交配株常染色體隱性遺傳衍化建立的2型糖尿病模型，以胰島素抵抗和胰島β細胞功能減退為特征，該模型是未經任何有意識的人為處置，在自然條件下發生糖尿病的小鼠模型，其優點為模型小鼠糖尿病的發生發展進程與人類2型糖尿病相似，近階段具有較高的應用價值[15，16]。首先，動員后采集外周血提取單個核細胞，用內皮祖細胞培養基誘導培養，經流式細胞術檢測EPCs特異性的表達產物CD34、CD133及CD309表達率達80%～90%，以及EPCs可攝取植物凝集素（UEA-1）和結合乙酰化低密度脂蛋白（acLDL），并表達內皮細胞和祖細胞的混合表型，證實絕大多數的細胞是EPCs。細胞的形態和功能檢測也表明已經成功分離培養出EPCs。本實驗采用密度離心法從動員后的小鼠外周血中分離單個核細胞，經離心制成重懸的細胞，移入含有血管內皮生長因子等多種生長因子的特殊培養基，誘導細胞分化成EPCs。在第6天倒置顯微鏡下觀察細胞成橢圓形或梭形，大小不等，細胞密集，可見有部分細胞貼壁;此時細胞形態還未穩定。到達第15天可見細胞逐漸伸出偽足，形成紡錘體樣，細胞基本完全貼壁，細胞融合成鋪路石樣生長。經流失細胞術和攝取UEA-1和結合acLDL雙熒光染色鑒定已經成功分離。

EPCs具有增殖，遷移和成管的生物學特性，在一定的刺激下可募集，歸巢到血管受損處，參與血管的重建和修復。目前認為 EPCs 促進血管新生的機制包括兩個方面：一方面是通過自身的分化增殖而形成新生血管，無需依賴原來的血管系統;另一方面，EPCs 本身可以分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等細胞因子，通過旁分泌效應增強局部血管內皮細胞，即增強血管生成效應[17]。而大量研究發現糖尿病狀態下的EPCs功能和活性受到抑制[3，4]。Maiorino MI等[18]發現循環CD34+細胞水平的降低提示日本2型糖尿病患者冠心病的發生有關，此外，與非糖尿病患者相比，2型糖尿病損害了急性心肌梗死后CD133+細胞數量的增加和趨化反應，這可能解釋了缺血后血管延遲愈合和心肌恢復[19]。有研究將健康人和糖尿病患者的EPCs移植到裸鼠損傷的頸動脈內，發現與健康人EPCs比，糖尿病患者EPCs在體內再內皮化和抑制內膜增厚能力更低。

本實驗檢測了2型糖尿病EPCs的體外功能，發現功能較正常小鼠低，這與之前的研究一致。糖尿病狀態下EPCs的數量和功能是修復創面的關鍵因素。目前雖有大量有關改善糖尿病環境下EPCs功能文獻報道。如抑制炎癥反應，氧化應激，促進動員，抑制凋亡等。但闡明糖尿病EPCs功能障礙的機制對于將其應用于創面修復是至關重要。而通過體內動員，外周血體外擴大增殖培養自體移植可以避免免疫反應及骨髓穿刺的痛苦。這有望成為治療和預防糖尿病等難治愈創面的新希望。

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收稿日期：2020-03-10;修回日期：2020-03-22

編輯/肖婷婷

基金項目：國家自然科學基金資助項目（編號：81660321）。

作者簡介：潘滿昌（1990.1-），男，云南昆明人，碩士，住院醫師，主要從事慢性創面愈合方向的研究

通訊作者：汪虹（1963.10-），男，云南昆明人，碩士，主任醫師，主要從事創面修復方向的研究