ASIC1a對(duì)急性肺損傷大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

朱月琴，潘學(xué)勝，杜 娜，劉敬浩，劉 蘭，吳 縣，王媛媛，胡成穆，黃 艷

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由敗血癥、創(chuàng)傷、休克等各種肺內(nèi)、外因素所致的急性缺氧性呼吸衰竭，其發(fā)展到一定階段(氧合指數(shù)>200)稱為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[1]。ARDS起病快，病情發(fā)展猛烈，死亡率高達(dá)30%以上[2]。Ashbaugh et al[3]在1967年提出肺損傷，有關(guān)ALI的研究很多，但患病率和死亡率依然很高。因此，ALI的發(fā)病機(jī)制和臨床治療是臨床重癥監(jiān)護(hù)領(lǐng)域的重點(diǎn)和重要研究方向。

酸敏感離子通道(acid-sensitive ion channels, ASICs)是上皮鈉通道(ENaC/DEG)超家族中的一類陽(yáng)離子通道蛋白復(fù)合物，參與了炎癥、局部缺血和腫瘤等伴有組織酸化的疾病[4]。ASIC1a是ASICs亞基中能通透Ca2+的主要亞基，當(dāng)胞外pH下降時(shí)可被激活[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)可通過(guò)缺血缺氧、氧化應(yīng)激、缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸，葡萄糖等)和Ca2+-ATP酶抑制劑介導(dǎo)[6-9]，這些因素也是ALI發(fā)病過(guò)程中的常見(jiàn)因素。ASIC1a和ERS均參與ALI疾病的發(fā)生發(fā)展，且其變化均與Ca2+水平有密切聯(lián)系，而兩者在ALI發(fā)病中是否有關(guān)聯(lián)，且機(jī)制如何，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。因此擬在課題組前期研究ASIC1a通道及ALI的基礎(chǔ)上，在LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠模型中，檢測(cè)ASIC1a對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響，為臨床預(yù)防和治療ALI以及新藥開(kāi)發(fā)提供新的方向和思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量(180～220)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SYXK(皖)2017-006，飼養(yǎng)于溫度為(25±2) ℃和濕度為60%的室內(nèi)，通風(fēng)良好，人工控制12 h晝夜節(jié)律，可自由攝食飲水。

1.1.2藥品與試劑 脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、阿米洛利(美國(guó)Sigma公司)；地塞米松(美國(guó)Solarbio公司)；細(xì)胞組織裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF、一抗稀釋液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ASIC1a一抗(美國(guó)Affinity公司)；β-actin一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；TRIzol裂解液(美國(guó)ThermoFisher公司)；山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；PVDF膜(北京索萊寶科技有限公司)；顯影液(美國(guó)Advansta公司)； ELISA試劑盒(武漢基因美生物技術(shù)有限公司)；BD動(dòng)脈血液采集裝置(新鄉(xiāng)市康爾健醫(yī)療用品有限公司)。

1.1.3主要儀器 Centrifuge 5424 R冷凍離心機(jī)(德國(guó)eppendorf公司)；小型垂直電泳槽、小型 Trans-blot 轉(zhuǎn)印槽(濕轉(zhuǎn))、基礎(chǔ)型電泳電源(美國(guó)Biorad公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；4 ℃、-20 ℃低溫冰箱(日本三洋公司)；ChemiDoc MP System 全能型成像系統(tǒng)、CFX Connect 實(shí)時(shí)定量 PCR 儀(美國(guó)Biorad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)處理與分組 40只雄性SD大鼠，隨機(jī)均分為4組：對(duì)照組、模型組、阿米洛利組、地塞米松組。對(duì)照組和模型組各自腹腔注射生理鹽水2 ml，阿米洛利組和地塞米松組分別腹腔注射2 ml阿米洛利(10 mg/kg)和2 ml地塞米松(5 mg/kg)，30 min后，對(duì)照組腹腔注射1 ml生理鹽水，其余3組注射1 ml LPS(5 mg/kg)。處理完成16 h后，通過(guò)腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(3%，40 mg/kg)麻醉，取腹主動(dòng)脈血以及肺組織留存。

1.2.2HE染色 取大鼠右肺下葉，4%多聚甲醛固定后包埋在石蠟中，切片，HE染色，封固，光鏡下觀察。

1.2.3ELISA法檢測(cè)大鼠血清中白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)表達(dá) 將取出的血液4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離出血清。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定每個(gè)標(biāo)本血清中IL-6的表達(dá)水平。為每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置雙重復(fù)孔，以獲取酶標(biāo)儀在450 nm處吸光度(optical density，OD)值。根據(jù)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各個(gè)樣本IL-6含量。

1.2.4免疫組化檢測(cè)肺組織中ASIC1a蛋白表達(dá) 對(duì)肺組織右肺葉標(biāo)本進(jìn)行染色，高溫高壓抗原修復(fù)。封閉后滴加一抗過(guò)夜。洗脫后孵育二抗1 h，DAB顯色后水洗，蘇木精復(fù)染，烘烤組織切片，封片。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠肺組織相關(guān)基因 用TRIzol提取肺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，按以下程序擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性5 min，再以94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，87 ℃ 10 s；循環(huán)55次。選擇β-actin作為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計(jì)算各樣本葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)和絲氨酸/蘇氨酸 - 蛋白激酶/內(nèi)切核糖核酸酶肌醇需要酶1(inositol-requiring kinase 1，IRE-1)、人X盒結(jié)合蛋白1(X box binding protein 1，XBP-1)的相對(duì)表達(dá)量，引物由生工生物工程(上海)有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列如表1所示。

表1 RNA引物序列

1.2.6Western blot檢測(cè)肺組織中相關(guān)蛋白的表達(dá) RIPA裂解液提取肺組織總蛋白后，根據(jù)BCA試劑盒測(cè)定各組的蛋白含量，調(diào)整蛋白濃度并加入上樣緩沖液。SDS-PAGE電泳分離90 min，200 mA恒流2 h轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。TBST洗去封閉液，加入GRP78、CHOP、ASIC1a等一抗(1 ∶ 1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST在搖床上洗滌后將膜放入通用二抗中,并在室溫下慢搖溫育1 h，洗滌后經(jīng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像，并使用Image J軟件進(jìn)行分析，將各目的蛋白條帶熒光強(qiáng)度與內(nèi)參蛋白β-actin比較，判斷各組目的蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理學(xué)變化大鼠肺組織染色結(jié)果顯示，對(duì)照組肺泡腔結(jié)構(gòu)清晰，間質(zhì)血管無(wú)充血。模型組中肺泡的正常結(jié)構(gòu)消失，肺泡隔增厚且間隙變窄，一些肺泡腔塌陷，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)肺泡腔，微血栓形成。與模型組相比，阿米洛利組和地塞米松組中大鼠肺間質(zhì)及肺泡出血滲出較模型組減輕。見(jiàn)圖1。

2.2 血清炎癥因子IL-6的表達(dá)變化模型組血清IL-6(71.54±0.9316) pg/ml高于對(duì)照組(49.03±0.7035) pg/ml(t=19.28，P<0.01)。阿米洛利組(53.87±0.4263) pg/ml和地塞米松組(41.44±1.1380) pg/ml血清中IL-6的水平均低于模型組(F=230.3，P<0.01)。

圖1 各組肺組織HE染色結(jié)果 ×200

A：對(duì)照組；B：模型組；C：阿米洛利組；D：地塞米松組

2.3 ASIC1a在各組大鼠肺組織中的表達(dá)免疫組化法測(cè)定肺組織中ASIC1a的表達(dá)，結(jié)果如圖2，模型組中ASIC1a的表達(dá)量較對(duì)照組增加，阿米洛利組和地塞米松組相比于模型組減少。

圖2 各組肺組織ASIC1a的免疫組織化學(xué) ×400

A：對(duì)照組；B：模型組；C：阿米洛利組；D：地塞米松組

2.4 各組大鼠肺組織中GRP78和CHOP及下游基因mRNA的表達(dá)變化模型組大鼠肺組織中GRP78、CHOP mRNA的表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而阿米洛利組和地塞米松組中GRP78、CHOP mRNA表達(dá)量與模型組相比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3。模型組中IRE-1和XBP-1的表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而阿米洛利組和地塞米松組中IRE-1、XBP-1 mRNA的表達(dá)量與模型組相比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

圖3 各組大鼠肺組織中GRP78和CHOP的mRNA表達(dá)(n=3)

與對(duì)照組比較：**P<0.01;與模型組比較：##P<0.01

圖4 各組大鼠肺組織中IRE-1和XBP-1的mRNA表達(dá)(n=3)

與對(duì)照組比較：**P<0.01;與模型組比較：##P<0.01

2.5 Western blot法檢測(cè)大鼠肺組織中GRP78、c-caspase12及下游基因IRE-1和XBP-1蛋白表達(dá)的變化模型組大鼠肺組織中GRP78和c-caspase-12的蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。阿米洛利組和地塞米松組中GRP78和c-caspase-12的蛋白表達(dá)量與模型組相比均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖5。而模型組中IRE-1和XBP-1的蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，阿米洛利組和地塞米松組中IRE-1和XBP-1的蛋白表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖6。

2.6 Western blot檢測(cè)大鼠肺組織中AKT的表達(dá)及其磷酸化水平模型組大鼠肺組織中AKT的磷酸化水平(p-AKT)高于對(duì)照組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。阿米洛利組和地塞米松組中p-AKT與模型組相比明顯下降(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖7。

圖5 各組大鼠肺組織中GRP78和c-caspase-12的蛋白表達(dá)(n=3)

A：對(duì)照組；B：模型組；C：阿米洛利組；D：地塞米松組；與對(duì)照組比較：**P<0.01;與模型組比較：##P<0.01

圖6 各組大鼠肺組織中IRE-1和XBP-1的蛋白表達(dá)(n=3)

A：對(duì)照組；B：模型組；C：阿米洛利組；D：地塞米松組；與對(duì)照組比較：**P<0.01;與模型組比較：##P<0.01

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)各組大鼠的肺組織切片進(jìn)行HE染色觀察病理學(xué)變化以及ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清中IL-6的表達(dá)差異，證明ALI大鼠模型造模成功。本實(shí)驗(yàn)在前期課題組研究ASIC1a在大鼠ALI肺組織的表達(dá)的基礎(chǔ)上，探究大鼠ALI肺組織中ASIC1a的上調(diào)對(duì)ERS反應(yīng)的影響。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠模型中ASIC1a的表達(dá)增加，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot結(jié)果顯示模型組的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)標(biāo)志性基因的mRNA和蛋白表達(dá)增加，提示ALI的發(fā)病過(guò)程有ERS反應(yīng)的發(fā)生。

圖7 各組大鼠肺組織中AKT和p-AKT的蛋白表達(dá)(n=3)

A：對(duì)照組；B：模型組；C：阿米洛利組；D：地塞米松組；與對(duì)照組比較：**P<0.01;與模型組比較：##P<0.01

目前的研究[10]顯示ALI的疾病發(fā)生機(jī)制可能與肺泡液體清除異常等因素相關(guān)，而上皮鈉通道在清除肺水腫液中起重要作用。課題組前期研究[11]表明LPS導(dǎo)致ALI大鼠的肺組織中ASIC1a的表達(dá)量顯著增加，結(jié)果表明ALI的發(fā)病機(jī)制可能與ASIC1a的開(kāi)放有關(guān)。并且有研究[12]顯示ASIC1a通路的表達(dá)也與Ca2+水平的調(diào)控密切相關(guān)。而阿米洛利作為ASIC1a的阻斷劑，和陽(yáng)性對(duì)照藥地塞米松對(duì)ALI都有一定的治療作用，可以抑制模型組中ASIC1a的表達(dá)，減輕ALI的病情，ERS反應(yīng)也相應(yīng)減輕。提示ALI肺組織中ASIC1a與ERS存在關(guān)聯(lián)性，ASIC1a可以介導(dǎo)ERS反應(yīng)，影響疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸。

作為真核細(xì)胞中的重要細(xì)胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具備多種生理功能，例如折疊翻譯蛋白和均衡細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)定性。ERS是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)激活胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)對(duì)腔內(nèi)未折疊蛋白的壓力作出反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的積累[13]。另有研究[14]證明，ERS參與了ALI和糖尿病等病癥。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+信號(hào)，儲(chǔ)存Ca2+，且已有報(bào)道ALI的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程有ERS參與[15]。并發(fā)現(xiàn)ALI疾病的發(fā)生機(jī)制也與Ca2+水平的調(diào)控密切相關(guān)[16]。課題組前期證明了ASIC1a可能參與ALI發(fā)病，抑制ASIC1a的表達(dá)能夠在一定程度上有效地減輕ALI[11]。另外，肝纖維化以及活化的肝星狀細(xì)胞中ASIC1a活化并發(fā)生膜轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)存在ERS的發(fā)生，而ASIC1a活化可誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，誘發(fā)ERS，此過(guò)程受PI3K/AKT通路的調(diào)控[17]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上旨在探究大鼠ALI進(jìn)程中ERS是否發(fā)生及其與ASIC1a的表達(dá)變化之間的關(guān)聯(lián)，為進(jìn)一步研究ALI的ERS特異性機(jī)制提供新的思路和方法。

抑制ASIC1a的表達(dá)可以減輕ALI的程度，大鼠肺組織的ERS相關(guān)蛋白減少。提示LPS誘導(dǎo)ALI大鼠肺組織中ASIC1a的上調(diào)可能參與誘導(dǎo)ERS過(guò)程。