右美托咪定腹腔注射對老齡大鼠全腦缺血再灌注損傷的預防作用及其機制

陶靜，周銘, 孫秋雁，彭安林

1武漢市肺科醫院藥學部，武漢 430030；2 武漢市皮膚病防治院； 3 湖北中醫藥大學藥學院

腦血管疾病為當今全球主要的致死性疾病；其中，腦缺血、卒中等缺血性腦病發病率較高，占比較大，尤其是腦缺血發病人數逐年遞增[1]。臨床上腦缺血治療的原則是盡可能快地恢復缺血區組織血液灌注。然而，腦缺血治療中恢復血流灌注的同時也產生了大量的活性氧(ROS)，ROS會加劇缺血區組織的氧化應激過程，導致大量氧自由基進一步釋放，造成腦缺血再灌注損傷[2]。前期有研究[3～5]報道，右美托咪定(Dex)可通過抑制氧化應激反應減輕大鼠全腦缺血再灌注損傷，但具體的病理生理機制仍不明確。2019年1～12月，本研究進一步驗證了Dex腹腔注射對老齡大鼠全腦缺血再灌注損傷的預防作用，并探討了其預防機制，為豐富臨床治療及機制探討提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑、儀器 清潔級老年SD大鼠36只，月齡20～22個月，體質量(450±20)g，購于華中科技大學實驗動物中心，動物合格證號：NO.42009800001823。于室溫、常規環境下喂養。Dex(江蘇恒瑞醫藥有限公司，批號：10061534)；超氧化物歧化酶(SOD )、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)等生化試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。抗體包括β-actin(稀釋濃度比為1∶3 000)、核因子E2相關因子(Nrf2)(稀釋濃度比為1∶500)、血紅素單加氧化酶-1(HO-1)(稀釋濃度比為1∶400)等，兔種屬來源一抗均購于美國Abcom公司，兔二抗購于武漢Antijie Biocom有限公司。BCA蛋白測定試劑盒、Western blotting 電泳凝膠試劑盒均購自武漢百奧斯公司。FA1004分析天平購自北京中儀公司。飛鴿牌離心機購自上海儀天科學儀器有限公司。TB-85型恒溫水浴鍋購自日本島津公司；KHB ST-360酶標儀購自上海科華有限公司。免疫印跡Western blotting電泳系統購自美國Bio-Rad有限公司。

1.2 大鼠分組、Dex給予方法、腦缺血再灌注操作方法 老年大鼠適應喂養兩周后，采用隨機數字表法分為Dex組(n=12)、模型組(I/R，n=12)、假手術組(S，n=12)。S組無電凝閉塞及夾閉雙側動脈處理。I/R組和Dex組采用文獻[6,7]報道方法，并根據實際情況進行改良后，運用四動脈阻斷法制備全腦缺血再灌注損傷大鼠模型：自由飲水、禁食12 h后，10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(0.4 mL/100 g)固定于操作臺，備皮、暴露頸部，于第1頸椎處采用2.5%碘伏進行消毒，單極電凝對準橫突孔燒灼雙側椎動脈，使其形成永久性閉塞；然后于頸部作一切口，鈍性分離腺體及皮下組織，暴露雙側頸動脈，準備好絲線，消毒縫合。待自然蘇醒24 h后，提起外置絲線分離的頸總動脈，采用動脈夾夾閉雙側頸動脈，形成4動脈閉塞的全腦缺血模型。夾閉10 min后，松開動脈夾再灌注24 h。Dex組夾閉雙側頸總動脈前30 min腹腔注射50 μg/kg的 Dex，S組和I/R組給予等量生理鹽水。缺血再灌注24 h后，處死再斷頭取腦，冰下剝離腦組織，進行相關生化指標測定。

1.3 各組腦組織病理觀察 斷頭取腦，冰下剝離腦組織，每組部分腦組織(n=4)固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋常規切片(厚度4 μm)。然后，進行常規病理HE(蘇木素及伊紅)染色，光學顯微鏡下觀察腦組織海馬區病理改變。

1.4 各組腦組織SOD、CAT、MDA的測定 稱取各組大鼠(n=8)腦組織，采用生理鹽水進行組織勻漿，制備10%的腦組織勻漿液。根據試劑盒說明書操作步驟測定腦組織SOD、CAT、MDA。

1.5 各組腦組織Nrf2和HO-1蛋白的測定 采用Western blotting法測定。冰下解剖腦組織后，采用含1%苯甲磺酰氟(PMSF)的裂解液裂解腦組織，提取總蛋白。4 ℃下12 000×g離心15 min后取上清；然后采用BCA試劑盒(武漢安特捷)測定腦組織總蛋白含量。加入適量裂解液將各組蛋白調至相同濃度，最后加入5×上樣緩沖液，沸水浴煮10 min變性，冰箱20 ℃凍存。取20 μL樣品上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后濕轉法轉膜2.5 h，轉膜成功后5%脫脂奶粉封閉1 h。根據Marker條帶剪下PVDF膜上不同目的條帶，分別加兔抗大鼠的β-actin、Nrf2和HO-1一抗，并置于4 ℃冰箱孵育過夜，次日搖床振蕩下采用TBST洗滌多次(15 min×3次)。洗滌后孵育二抗：加入 1∶3 000 的二抗室溫孵育1 h。同樣采用TBST洗滌后ECL 法曝光顯影，觀察Nrf2和HO-1蛋白的表達，結果以灰度值表示。

2 結果

2.1 各組大鼠大腦海馬組織病理變化 各組大鼠海馬HE染色結果如圖1所示，Dex組缺血損傷較I/R組明顯減輕，細胞形態規則，排列較為整齊；I/R組則呈現缺血壞死，組織排列紊亂、細胞破碎，典型的缺血損傷； S組大鼠皮質層細胞排列整齊規則，無缺失。

圖1 各組大腦海馬組織結構(HE染色)

2.2 各組大鼠腦組織SOD、CAT活性及MDA含量比較 與S組比較，I/R組SOD和CAT活力明顯下降，MDA含量升高(P均<0.05)。Dex組腦組織SOD、CAT活性較I/R組增加，MDA含量降低(P均<0.05)，詳見表1。

表1 各組大鼠腦組織SOD、CAT活性及MDA含量

2.3 各組大鼠腦組織細胞核內Nrf2、HO-1蛋白表達水平比較 Dex組、I/R組、S組大鼠腦組織細胞核內Nrf2分別為0.91±0.06、0.81±0.05、0.41±0.08，HO-1分別為1.18±0.05、0.91±0.04、0.31±0.09。各組之間各指標兩兩比較，P均<0.05。各組大鼠腦組織細胞核內Nrf2、HO-1蛋白電泳圖見圖2。

3 討論

正常生理狀態下，機體內氧化和抗氧化處于一種動態平衡。大腦作為人體的重要器官，在病理狀態下如腦缺血再灌注損傷過程中，氧化和抗氧化失衡，一系列氧化應激反應被激活，進而產生大量的超氧陰離子、氫氧根離子等氧自由基，可與腦細胞表面的不飽和脂肪酸結合發生脂質過氧化反應，代謝生成有害物質，損害腦組織，加重腦缺血損傷[8]。SOD和CAT作為生理平衡中不可或缺的抗氧化酶，能清除氧自由基，減少脂質過氧化物等對腦組織的毒性損傷[9]。Dex是臨床上應用非常廣泛的麻醉藥物，是α2腎上腺素受體激動劑，在大腦、腎臟、心臟等臟器缺血再灌注中通過抗氧化發揮一定的保護作用[10～12]，然而具體的作用機制仍不清楚。

圖2 各組大鼠腦組織細胞核內Nrf2、HO-1蛋白表達電泳圖

心腦血管疾病多發于老年群體，因此本研究探討了老年大鼠全腦缺血再灌注模型中，Dex抗氧化保護腦組織可能的具體作用機制。結果發現，I/R組大鼠腦組織中SOD和CAT活性較S組下降，而MDA含量明顯增加，提示大量氧自由基侵襲細胞，生成的脂質過氧化物損害腦組織導致細胞破裂、凋亡。Dex可以抑制機體的氧化應激反應，使大腦中SOD和CAT活性上升，清除氧自由基，有害物質MDA生成進而減少[13,14]，給予Dex干預后，腦組織缺血損傷較I/R組明顯減輕，提示Dex通過提高SOD和CAT活性，從而減少了MDA對大鼠腦組織損傷。

有研究[15]表明，Nrf2是細胞發生氧化應激的感受器，是介導抗氧化應激反應的重要轉錄因子, 在氧化和抗氧化過程中發揮了一定的防御作用。Nrf2可與肌動蛋白結合蛋白Keapl結合，使HO-1表達上調，激活Keapl/Nrf2/HO-1通路，誘導抗氧化酶SOD、CAT等活性增加，清除氧自由基等有害物質，維持機體氧化還原調節的平衡，發揮細胞保護作用。靜息狀態下，Nrf2與Keapl結合形成Keapl-Nrf2二聚體位于細胞質中，當受到來自ROS或外界氧化應激信號刺激時，Nrf2 磷酸化轉入細胞核，進而啟動下游HO-1和SOD、CAT基因的表達，發揮抗氧化作用。全腦缺血再灌注損傷導致腦組織中超氧陰離子、氫氧根離子等大量釋放，氧化應激反應被激活。本研究結果顯示，與S組比較，I/R組細胞核內Nrf2和HO-1水平明顯增加，表明機體存在自身免疫調節，可抵御氧化應激損傷；Dex組Nrf2表達較I/R組顯著上調，其信號通路下游的HO-1表達也明顯增多，提示Dex可以促進細胞核內Nrf2/HO-1的表達上調，增加 SOD、CAT 活性，降低MDA 含量，減少氧化應激對腦細胞的損傷和凋亡。

綜上所述，Dex對老齡大鼠全腦缺血再灌注損傷有一定的預防作用，其作用機制可能是上調Nrf2、HO-1蛋白的表達而抑制氧化應激反應。本研究僅進行了Dex對老齡大鼠全腦缺血再灌注損傷預防作用分子機制方面的探討，后續將在細胞水平進一步分析Dex的作用機制。