云南佤族和布朗族人群藥物基因組學基因遺傳差異

代 潤，張 嬋，程瑜靜，陳婉璐，李 琦，王玉明

（1） 云南省第一人民醫院輸血科，云南昆明 650100；2） 昆明醫科大學第二附屬醫院檢驗科，云南昆明 650101）

隨著醫學的不斷發展，醫學知識、技術與科學數據正處于前所未有的融合階段，對患者治療方式的選擇就變得極其重要。個性化醫療正是基于這一點，綜合考慮每個患者的特點，選擇最適合個人的最佳治療方法。其范圍更加廣泛，包括藥物基因學、藥物基因組學等。其中，藥物基因組學是識別個體對特定藥物反應中起作用的基因變異，包括劑量需求、療效和藥物不良反應風險的差異[1]。近年來，大量藥物基因組學研究主要集中在與藥物動力學或臨床相關藥物的藥效學相關的VIPs（Very important drug genes） 上[2]，它們主要在藥物的吸收、分布、代謝、消除，以及藥物的分子靶點/通路中發揮至關重要的作用[3-4]。

目前人們對藥物基因組學不斷深入的研究，研究者發現與藥物反應相關的基因變異在不同的種族中是不同的[5-7]。中國是個人口大國，擁有56 個民族，其中，云南省是我國少數民族最多的省份，云南特有的少數民族中佤族約43 萬人口，布朗族約11 萬人口。雖然人類基因組計劃研究了全球人口樣本，但許多少數民族的藥物基因組學信息仍然是未知的。

筆者研究了云南佤族和布朗族VIP 位點的基因型和等位基因頻率分布，并且將佤族和布朗族分別和其他8 個種群進行比較，以評估等位基因頻率的差異。研究結果為進一步完善藥物基因組學數據庫信息，了解藥代遺傳及其多樣性提供初步的依據，更好地了解佤族和布朗族人群的進化歷程，為更安全的藥物給藥和今后云南省開展合理的個體化健康管理提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

從云南省隨機招募了200 名無親緣關系的健康人，其中佤族100 名，布朗族100 名。每個參與者都經過了嚴格的調查，在三代以內均是相同的種族，且無任何疾病。近年來雖然受漢族的影響較大，但是他們與其他民族之間的交流較少，仍然保持了各自民族獨特的特點。所有參與者對本研究的實驗方案已知悉并簽署知情同意書，且該研究得到云南省第一人民醫院倫理委員會審批通過。另外，該研究方案符合衛生與公眾服務部（department of health and human services，DHHS） 關于人體研究課題保護的規定。

1.2 位點選擇和基因分型

筆者搜索了PharmGKB 數據庫（https://www.pharmgkb.org/） 并從中選取了40 個位點進行研究。根據全血基因組DNA 純化試劑盒的說明書，筆者從參與者的血液中提取基因組DNA，采用NanoDrop 2000C 分光光度計測定DNA 濃度。

使用Agena MassARRAY 陣列設計軟件對單核苷酸多態性（SNP） 位點進行引物設計[8]，并使用Agena MassARRAY RS1000 軟件進行基因分型，最后用Agena Typer 4.0 軟件進行數據收集。

1.3 群體遺傳結構分析

此外，筆者使用Arlequin 軟件和Structure2.3.4軟件來觀察9 個民族的人群結構。首先，在貝葉斯聚類算法的基礎上，筆者進行了群體結構分析，將樣本分配到假設的K 個種群內。其中，每個個體都是由一個垂直的列來表示的，這些列被分割成不同的顏色部分。其次，Fst 值是在種群和進化遺傳學中應用最廣泛的描述性統計。運用Arlequin 軟件分別完成了佤族和布朗族與其他8 個種族的Fst值的計算，以推斷群體中兩兩之間的距離。

1.4 統計學處理

用SPSS 軟件于檢測每個VIP 位點的頻率是否符合哈德-溫伯格平衡定律，如符合，進一步對佤族和布朗族進行了VIP 位點的基因型頻率等檢測，并依據千人基因組計劃數據庫分別將佤族和布朗族與其他8 個種族通過卡方檢驗進行基因型頻率比較，包括（1） 東亞： CHS（中國南方漢族），KHV（胡志明市越南人）；（2） 南亞：BEB（孟加拉國的孟加拉人）；（3） 歐洲：GBR（英格蘭和蘇格蘭人）；（4） 美國：CLM（哥倫比亞麥德林的哥倫比亞人）；（5） 非洲：ACB（在巴巴多斯的非洲加勒比海人），GWD（岡比亞西部地區的岡比亞人）。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VIP 位點的基本信息

所選40 個VIP 位點（其中有10 個位點不符合哈德-溫伯格平衡定律，已將其剔除。） 在佤族和布朗族中的基本信息，包括SNP_ID 號、基因名稱、位置、核苷酸變化、功能變化、等位基因等，見表1。

2.2 佤族與其他8 個人群中的基因型頻率比較分析

佤族人群的基因型頻率分布和其他8 個人群的基因型頻率分布比較的p值結果如表2 所示。筆者發現，校正前，與中國云南布朗族、CHS、KHV、BEB、GBR、CLM、ACB、GWD 群體分別進行比較，中國云南佤族分別有3，5，10，15，18，18，26，22 個不同的VIP 位點。Bonferroni 校正后，中國云南佤族分別有0，2，0，10，11，9，15，17 個不同的VIP 位點。VDR rs11568820（P=0.002，P=9.3E-06，P=1.0E-04，P=2.3E-04，P=9.3E-13，P=1.2E-13，P=1.1E-05 和P=4.7E-11） 和COMT rs4680（P=0.172，P=0.005，P=0.034，P=3.3E-09，P=1.8E-12，P=5.0E-06，P=4.2E-04 和P=0.026） 在中國云南佤族人群中表達較其他8 個群體有顯著差異。而rs6791924（P=1.3E-06 和P=5.8E-08），rs2066702（P=9.7E-09 和P=6.4E-07），rs1138272（P=5.8E-04）、rs59421388（P=2.1E-04） 和rs61736512 （P=2.1E-04） 的顯著性差異較小。

表1 VIP 位點的基本信息（1）Tab.1 The basic information of VIP variants（1）

2.3 布朗族與其他8 個人群中的基因型頻率比較分析

布朗族人群的基因型頻率分布和其他8 個人群的基因型頻率分布比較的P值結果如表3 所示。校正前，與中國云南佤族、CHS、KHV、BEB、GBR、CLM、ACB、GWD 群體分別進行比較，中國云南布朗族分別有3，7，10，17，20，19，25，24 個不同的VIP 位點。Bonferroni 校正后，中國云南布朗族分別有0，4，1，11，11，11，16，18 個不同的VIP 位點。NR1I2 rs3814055 在中國云南布朗族人群中表達較其他8 個群體有顯著差異（P=0.004，P=7.3E-06，P=0.008，P=2.7E-09，P=9.0E-13，P=1.1E-14，P=2.9E-13，和P=2E-11），而 rs6791924（P=1.3E-06 和P=5.8E-08），rs2066702（P=9.7E-09 和P=6E-07），rs1138272（P=5.8E-04）、rs59421388（P=2.1E-04） 和rs61736512（P=2.1E-04） 的顯著性差異較小。

表1 VIP 位點的基本信息（2）Tab.1 The basic information of VIP variants （2）

2.4 群體遺傳結構分析

為進一步鑒定9 個群體之間的祖先群體關系，筆者利用基于結構計算的基于模型的聚類方法進行了分析（K=3-9），如圖1 所示。隨著K 值的增加，亞組間的差異更加明顯。而K=3 被認為是最適當的值，可以將這些個體明確地分為三個祖先亞群，分別為：亞組1（中國云南布朗族、中國云南佤族、CHS、KHV），亞組2（BEB、GBR、CLM），亞組3（ACB、GWD）。結果表明，東亞地區的布朗族、佤族、CHS、KHV 人群的遺傳結構相似，此結果在表1 中得到了證實。

表2 佤族與其他8 個人群中的基因型頻率比較分析Tab.2 The comparative analysis of genotype frequency between Wa and other 8 populations

基于遺傳結構，進一步利用兩兩配對的Fst 值來評價9 個群體之間的遺傳關系（表4）。從表4中發現，中國云南布朗族、中國云南佤族與東亞地區的CHS、KHV 人群的Fst 值較小。Fst 值越小，人群遺傳結構越相似。結果表明，布朗族與佤族的關系最接近（Fst=0.003），其他種群次之。

3 討論

近年來發展的藥物基因組學通過關聯患者個體的遺傳物質與藥物的藥動學、藥效學特性，可以幫助醫師、藥師預測藥物療效、估算藥物劑量、調整給藥方案以及預防藥物不良反應發生，指導個體化合理用藥[9]。云南地區針對少數民族基因多態性的研究主要關于STR 基因座[10]，對藥物基因的多態性研究并不多見，朱柯穎等[11]人對云南彝族人群CYP4A11 rs9333025 基因A/G 多態性的分布進行過研究。在本次研究中，筆者對中國云南佤族和布朗族人群的VIP 位點進行了基因分型和等位基因頻率分布檢測，并將中國云南佤族和中國云南布朗族分別和其他8 個種群進行比較，對等位基因頻率的差異進行了評估。數據分析結果顯示，云南佤族與東亞地區的布朗族、CHS、KHV 的差異較小，而與其他地區的人群差異較大，尤其是非洲地區的人群。云南佤族與其他8 個人群比較，最為顯著的位點是VDR rs11568820 和COMTrs4680。云南布朗族與東亞地區的佤族、CHS、KHV 的差異最小，而與南亞、歐洲、美國、非洲地區的人群差異較大，尤其是非洲地區的人群。布朗族與其他8 個人群比較，最為顯著的位點是NR1I2 rs3814055，此結果與筆者以前的研究結果一致[12]。

表3 布朗族與其他8 個人群中的基因型頻率比較分析Tab.3 The comparison and analysis of genotype frequency between Blang and other 8 populations

圖1 9 個群體的遺傳結構分析Fig.1 Genetic structure analysis of 9 populations

表4 9 個種群的Fst 值Tab.4 Fst values among 9 populations

VDR（Vitamin D （1，25-dihydroxyvitamin D3） receptor，維生素D 受體） 基因定位于染色體12q13.11，是維生素D 途徑的重要調控因子，在該基因中發現了許多常見的SNP 位點。Rs11568820位于VDR 基因的5' 調節區域，rs11568820 等位基因A 被Rowland 等人發現侵襲性前列腺癌的風險增加有關[13]。一項由衛生專業人員進行的隨訪研究指出，25（OH） D 缺乏與前列腺癌風險呈負相關的關系，而Mikhak 等[14]發現，攜帶rs11568820 位點A 等位基因的男性，如果缺乏25（OH） D 基因，那么其患前列腺癌的風險將顯著降低。這些趨勢上的差異可能是由于種族差異造成的，因為研究是在所有美國男性的人群中進行的，而衛生專業人員的后續研究主要在歐洲男性人群中進行的。

COMT（Catechol-O-methyltransferase，兒茶酚-鄰甲基轉移酶） 是一種重要的雌激素代謝物結合失活的雌激素代謝酶[15]，由位于22q11 號染色體上的COMT 基因編碼。COMT 在多種人體組織中的表達量都很高，包括卵巢、乳腺、肝臟和腎臟組織。近日，有研究者發現，COMT rs4680 上的單個堿基的改變導致纈氨酸替代了蛋氨酸，被認為是使COMT 活性降低了3-4 倍的原因[16]。近年來這種酶被發現在受激素影響的癌癥的發展中起著至關重要的作用，例如，乳腺癌[17-19]，。Wan 等人的一項薈萃分析表明，COMT rs4680 位點可能會增加中國人群乳腺癌的易感性，特別是在絕經前的婦女人群中[18]。Lin 等人在總體分析中發現COMT rs4680 多態性與子宮內膜癌風險無顯著相關性，但在GA/GG 和（AA+GA）/GG 遺傳模型下，絕經后婦女人群中發現的風險顯著降低[17]。He 等[19]的研究表明COMT 基因多態性與降低白種人乳腺癌風險有關，而與其他人群無關。這些結果可能提示絕經狀態和種族差異對COMT rs4680 多態性與激素相關癌癥（包括卵巢癌） 的相關性有重要影響。

NR1I2（Nuclear receptor subfamily 1 group I member 2） 屬于核激素受體超家族，其主要作用是作為轉錄因子促進藥物和有毒外源性藥物的解毒和清除。Rs3814055 定位于NR1I2 的5’非翻譯區，在疾病風險的預測和藥物基因組學方面均已經引起了許多研究者的關注。大量研究表明，NR1I2 基因中rs3814055 的頻率在不同人群中是不同的。在中國漢族人群中該位點的頻率為0.218[5]，歐洲人為0.500[20]。有研究發現在珞巴族和苗族中該位點的T等位基因的頻率分別是0.101 和0.090[6-7]。在本研究中佤族和布朗族中rs3814055 的T 等位基因的頻率分別是0.840 和0.060。以上的研究再一次充分說明了等位基因頻率的分布受到了種群的影響。希望筆者的數據能夠補充藥物基因組學數據庫。

藥物基因學和藥物基因組學知識庫（PharmGKB:http://www.pharmgkb.org） 是解釋基因-藥物-疾病關系的極其有用的資源，擬在揭示這些遺傳變異與藥物反應之間的關系，為患者提供最合適的藥物類型和準確的最佳劑量指導，從而提高藥物的療效和安全性，是開發個性化藥物和患者藥物管理的重要基礎。然而，種族對藥物反應的差異很大，目前部分少數民族相關的研究還不夠充分。希望本研究的數據能夠補充佤族和布朗族的藥物基因組學信息，為其更安全的用藥以及新藥的開發提供一定的理論依據，并為個性化醫療的發展提供一些幫助。