基于細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ序列位點特異性聚合酶鏈反應鑒別鹿茸及其偽品

楊重暉 尹程程 宋文博

摘要 目的：基于細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）序列建立一種新的PCR鑒定方法，以快速鑒別出梅花鹿、馬鹿茸片與馴鹿茸片。方法：采集不同來源的鹿茸片共60批。通過比較梅花鹿、馬鹿與馴鹿等其他偽品的COⅠ基因序列差異，根據SNP鑒別位點設計梅花鹿茸、馬鹿茸同馴鹿茸的鑒別引物Cne-F、Rt-F、Co-R，并對影響聚合酶鏈反應（PCR）結果的主要因素變性時間、退火溫度、退火時間、延伸時間等進行方法學考察和優化。結果：該實驗構建的雙位點特異PCR鑒別體系，基于COⅠ的鑒別位點，可通過PCR擴增獲得294 bp的梅花鹿、馬鹿特異片段，而產生514 bp的馴鹿特異片段，偽品及陰性對照無條帶。結論：該實驗建立對梅花鹿、馬鹿及馴鹿等其他偽品鹿茸的PCR鑒別方法簡便、可靠。

關鍵詞 鹿茸;細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ;DNA;位點特異性;聚合酶鏈反應;分子鑒定

Abstract Objective：To establish a new PCR identification method based on COI sequence to quickly identify sika deer，Malurong Tablets and Xunlurong Tables.Methods：A total of 60 batches of Lurong Tablets from different sources were collected.By comparing the difference of COI gene sequences between fakes such as sika deer，red deer and reindeer，the identification primers Cne-F，Rt-F and Co-R of sika deer，red deer and reindeer velvet antler were designed according to the SNP identification location site.The main factors of polymerase chain reaction （PCR） results，such as denaturation time，annealing temperature，annealing time，and extension time，were investigated and optimized.Results：The two-site specific PCR identification system constructed in this study，based on the COI identification site，can obtain 294 bp sika deer and red deer specific fragments by PCR amplification，and produce 514 bp reindeer deer specific fragments，New Zealand red deer and other pseudo-pars and negative and control strip-free band.Conclusion：This experiment established a simple and reliable PCR identification method for other fake Cornu Cervi Pantotrichum such as sika deer，red deer and reindeer.

Keywords Cornu Cervi Pantotrichum; COⅠ; DNA; Site-specific PCR; Polymerase chain reaction; Molecular identification

鹿茸為鹿科動物梅花鹿Cervus nippon Temminck或馬鹿Cervus elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生鸞毛的幼角[1]，是吉林省名貴道地中藥材，具有壯腎陽，益精血，強筋骨，調沖任，托瘡毒等功效。鹿茸含有蛋白多肽類、糖類、生物胺類、甾體類等多種活性成分，具有提高機體免疫力、提高性功能、促進骨折的愈合、抗衰老等功能[2-6]。截至2019年12月，在國家食品藥品監督管理總局（http：//samr.saic.gov.cn/）查詢到含鹿茸的藥品已有107種，含鹿茸的保健食品已有15種。鹿茸藥材的供不應求導致大量偽品藥材流入市場，而與之相對應的鹿茸藥材鑒定與產品質量控制體系并不完善。傳統鑒定鹿茸的方法存在主觀性較大、特異性不強、通用性差、對觀察者經驗的要求高等缺陷，不利于規范化、標準化方法的建立及普及[7-8]。近幾年來，分子鑒定技術迅猛發展，成為傳統鑒定方法的強有力補充。DNA條形碼（DNA barcoding）技術是分子鑒定的最新發展，即通過比較一段通用DNA片段，對物種進行快速、準確的識別和鑒定[9-10]。DNA條形碼技術不受物種、性別、發育階段的影響，便于操作，易于標準化，準確性高，可以一次性快速鑒定大量樣本。應用DNA條形碼技術能夠快速、準確鑒定鹿茸的真偽[11-15]。本研究基于鹿科動物COⅠ序列，在同一PCR反應體系中檢測梅花鹿茸、馬鹿茸與馴鹿茸，以期達到快速、準確的鑒定鹿茸真偽的目的，從源頭控制鹿茸藥材質量。

1 材料與儀器

1.1 材料

鹿茸樣品購自吉林、新疆、河北、陜西等地，共計60份。樣品材料基本情況見表1。

1.2 試劑

血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，目錄號：DP304-03）;Ex Taq DNA Polymerase（寶日醫生物技術有限公司，目錄號：R060Q）;2 000 bp DNA Marker（全式金生物技術有限公司，目錄號：BM101-01）;10×Loading Buffer（Takara，日本，目錄號：9127），瓊脂糖（Biowest，法國，目錄號：YZQZT），溴化乙錠（源葉生物，目錄號：R20975），50×TAE Buffer（Meilunbio，目錄號：MA 0004）;實驗所需引物由吉林省庫美生物技術有限公司合成。

1.3 儀器

恒溫水浴鍋（江南實驗儀器廠，HH-2型）;離心機（德國Eppendorf公司，MiniSpin型）;電泳儀（日本TAKARA公司，Mupid-One型）;凝膠成像系統（美國Wealtec公司，Dolphin-Doc型）;核酸蛋白分析儀（日本島津公司，Biospec-nano型）。

2 方法

2.1 鹿茸樣品基因組DNA的提取

取鹿茸樣品0.1 g，依次用1 mL 75%乙醇、l mL滅菌超純水清洗，吸干表面水分，置于研缽中，加入液氮研磨成極細粉。取鹿茸樣品極細粉70 mg，置于1.5 mL離心管中，使用天根血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取DNA。提取步驟詳見說明書，將DNA溶液收集到離心管中，即為鹿茸樣品基因組DNA，置于-20 ℃冰箱中備用。

2.2 PCR擴增及序列測定

使用COI序列通用引物HCO2198：5′GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 3′，LCO1490：5′TGATTTTTTGGTCACCCTGAAAGTTTA 3′擴增鹿茸樣品的COI序列，PCR反應體系在200 μL離心管中進行，反應總體積為25 μL，反應體系包括10×PCR緩沖液2.5 μL，MgCl2（0.002 5 mol/L）2 μL，dNTP（0.002 5 mol/L）2 μL，上游和下游引物（0.01 mol/L）各0.25 uL，模板DNA 500 ng，Taq DNA聚合酶1.0 U，加無菌雙蒸水至25 μL，PCR反應參數為：94 ℃ 1 min;94 ℃ 1 min，45 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1.5 min，5個循環;94 ℃ 1 min，50 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，35個循環;72 ℃ 5 min。將PCR產物送至吉林省庫美生物技術有限公司進行序列測定。

2.3 系統鄰接樹構建

在NCBI中下載3條梅花鹿COI基因序列，3條馬鹿COI基因序列，1條馴鹿COI基因序列。使用BioEdit軟件將下載的序列同COI序列通用引物擴增產物測序結果進行序列比對;使用MEGA軟件對序列比對結果進行系統鄰接樹（NJ樹）的構建。通過系統鄰接樹信息分析，得到市售鹿茸真偽鑒定結果。

2.4 位點特異性PCR引物設計及PCR條件考察

根據測定的序列結果以及從NCBI中下載的梅花鹿茸、馬鹿茸、馴鹿茸的COⅠ序列，使用BioEdit軟件對COⅠ序列進行同源對齊，校對后分析梅花鹿茸、馬鹿茸與偽品馴鹿茸的物種差異SNP位點，利用DNAman軟件設計梅花鹿茸與馬鹿茸，馴鹿茸的位點特異性鑒別引物，引物信息見表2。

為獲得最優的位點特異性PCR反應條件，對其反應條件進行優化，分別考察DNA模板濃度（0.005 ng/μL、0.01 ng/μL、0.02 ng/μL、0.05 ng/μL、0.1 ng/μL、0.2 ng/μL、0.25 ng/μL、0.5 ng/μL、1 ng/μL、2 ng/μL）、退火時間（30 s、60 s、90 s）、退火溫度（54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃）、PCR循環次數（31次循環、33次循環、35次循環、37次循環）、延伸時間（1 min、5 min、10 min）、聚合酶種類（2×Taq PCR MasterMix Polymerase、transFast Taq DNA Polymerase、Ex Taq DNA Polymerase、PrimeSTAR Max DNA Polymerase）對PCR反應的影響。反應體系為：DNA模板約500 ng，DNA聚合酶1.25～2.5 U，上游與下游引物各0.2 μmol/L，0.2 mmol/LdNTP，1×PCR Buffer（含Mg2+），加無菌水補足至25 μL。

2.5 鹿茸片PCR鑒別方法驗證

以4批梅花鹿茸、4批馬鹿茸及10批馴鹿茸樣品總DNA為模板，使用鑒別引物Cne-F、Rt-F及Co-R進行PCR擴增，參照《中華人民共和國藥典》2015版[1]四部瓊脂糖凝膠電泳法（通則0541），使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，PCR產物的上樣量為2.5 μL，DNA分子量標記（400 ng/5 μL）上樣量為2 μL。電泳結束后，取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。

3 結果

3.1 系統鄰接樹信息分析結果

由于購買的市售鹿茸藥材中一些鹿茸藥材貯存狀況不佳，導致基因組DNA降解，從收集的60份中僅成功提取到42份鹿茸樣品DNA，經測序，得到36個鹿茸樣品DNA測序結果，經鑒定，有4個鹿茸藥材的實際鹿茸品種為馴鹿，與其商品標簽標示鹿茸品種不符。而其他市售的的馬鹿茸及梅花鹿茸種源明確，皆為正品。見圖1。

3.2 PCR反應條件以及體系

最終確定PCR反應參數為：94 ℃預變性3 min，循環反應35次（94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min），72 ℃延伸5 min。PCR反應體系見表3。

3.3 鹿茸片PCR鑒別方法驗證

梅花鹿茸及馬鹿茸在凝膠電泳圖譜中，應在294 bp處有單一DNA條帶，常見偽品馴鹿茸在凝膠電泳圖譜中，在514 bp處應有單一條帶，空白對照無條帶。見圖2。

4 討論

中國是世界上養鹿最早的國家，也是將鹿茸應用于醫藥保健事業最早的國家。目前，鹿茸作為一種名貴的中藥材，已被廣泛應用于我國中醫、中藥、生物制藥、保健藥品、保健食品等行業中。《中華人民共和國藥典》2015版中明確規定梅花鹿茸及馬鹿茸為鹿茸正品，由于市場需求連年增加，鹿場鹿茸產出量有限，一些不法分子利用馴鹿茸等其他鹿茸偽品以假亂真，偽品鹿茸與正品鹿茸同價不同效，導致臨床應用以及相關產品療效大打折扣，嚴重威脅著臨床用藥安全以及中藥藥品質量安全，傳統的鹿茸鑒別手段主要有性狀鑒別、理化鑒別等，這些鑒別手段一定程度上能夠區分鹿茸正品與偽品[16-18]，但是由于方法本身存在的局限性，仍然有一些偽品以及摻偽品無法準確鑒定。為了解決這一困境，急需開發一種高效、快速、準確的鹿茸鑒別方法。

DNA條形碼技術是近年來迅速興起的快速準確鑒定中藥材的分子生物技術，已經廣泛應用于動植物藥的鑒別中，尤其適用于鑒別多基原中藥。將分子鑒定技術應用于鹿茸鑒別，采用DNA條形碼高效準確的鑒別鹿茸是近年來的研究熱點。研究者開展了相關的研究：李明月等[19]針對梅花鹿茸及新西蘭鹿鹿茸進行了特異性PCR鑒別研究，結果在相同條件下，2種鹿茸可以擴增出不同數目的條帶，從而進行區分;錢潤等[20]根據Cytb片段上的3個單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）變異位點建立了鹿茸鹿角特異性PCR鑒別方法以鑒別鹿茸、鹿角正品與其他偽品;魏藝聰等[21]基于COⅠ與SRY序列建立了梅花鹿、馬鹿及其雜交鹿茸的分子鑒別方法;高麗君等[22]采用雙重引物對鹿茸正偽品進行擴增鑒別，以上研究不同程度的實現了梅花鹿茸、馬鹿茸的真偽鑒別。

馴鹿（Rangifer tarandus），又名角鹿，是鹿科馴鹿屬下的唯一的動物。由于馴鹿茸片價格偏低并且外觀容易與正品鹿茸片混淆，故而市售的商品鹿茸片中馴鹿茸片占有很大比例，有必要對其加以區分。本研究廣泛收集了不同產地、廠家、批號的60批鹿茸樣品，利用通用引物擴增測序，構建了系統鄰接樹，對市售鹿茸片進行了真偽鑒別;從NCBI中下載了梅花鹿、馬鹿、馴鹿的COⅠ序列，設計出了梅花鹿茸和馬鹿茸，馴鹿茸的位點特異性鑒別引物，考察了PCR反應條件及體系組成，同一個PCR反應體系中，可同時檢測梅花鹿、馬鹿茸和馴鹿茸的存在，建立了一種新的梅花鹿、馬鹿茸片與偽品馴鹿茸片的PCR鑒定方法，實現了對鹿茸片的正品鑒別及偽品檢出。本方法能夠明確區分鹿茸正品與馴鹿偽品，鑒別結果與測序結果一致，說明所開發的PCR鑒別鹿茸方法準確可信。

該方法簡單、快速，結果可靠，易于推廣應用。

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