基于網絡藥理學從系統層面探討黃芩苷治療肺纖維化的效應機制研究

張沂 穆杰 高偉華

摘要 目的：基于網絡藥理學的方法，從系統層面探討黃芩苷對肺纖維化的潛在作用機制。方法：通過NCBI pubchem、ZINC和TCMSP獲取黃芩苷的化合物信息，在NCBI數據庫、Pharmmapper數據庫獲取黃芩苷作用靶點，在DiseaseGene Network和DrugBank獲取肺纖維化的靶點，通過基因映射預測黃芩苷治療肺纖維化的潛在作用靶點，在STRING數據庫建立黃芩苷治療肺纖維化的高置信度PPI網絡，采用拓撲分析和富集分析，獲得拓撲重要性靶點及核心通路。結果：獲得黃芩苷作用靶點332個，肺纖維化靶點431個，黃芩苷潛在作用靶點45個，建立了1個45個節點、191條邊的高置信度PPI網絡，得到黃芩苷治療肺纖維化的拓撲重要性靶點21個，3條核心作用通路，及其涉及的20個生物過程（BP），4個細胞成分（CC），4個分子功能（MF）。結論：從網絡藥理學看黃芩苷治療肺纖維化的機制涉及多個靶點和信號通路，這些靶點與通路主要通過調節炎性反應、凋亡以及其他與治療肺纖維化作用有關的生理病理過程有關，為未來中藥研究提供了一個網絡藥理學框架。

關鍵詞 黃芩苷;肺纖維化;網絡藥理學;炎性反應;凋亡;信號通路;拓撲分析;富集分析

Abstract Objective：Based on the method of network pharmacology，the potential mechanism of Baicalin on pulmonary fibrosis was discussed from the systematical level.Methods：The information of baicalin compounds was obtained from NCBI pubchem，ZINC and TCMSP.The target of baicalin was obtained from NCBI database and Pharmmapper database.The target of pulmonary fibrosis was obtained from Disease Gene Network and Drug Bank.The potential target of Baicalin in the treatment of pulmonary fibrosis were predicted by gene mapping.A high confidence PPI network for baicalin in the treatment of pulmonary fibrosis was established in STING database.The important target and core path of topological were obtained by using topological analysis and enrichment analysis.Results：A total of 332 targets of baicalin，431 targets of pulmonary fibrosis and 45 potential targets of baicalin were obtained.A high confidence PPI network with 45 nodes and 191 edges was established.A total of 21 topologically important targets，3 core action pathways，20 biological processes （BP），4 cell components （CC） and 4 molecular functions （MF） involved in baicalin treatment of pulmonary fibrosis were obtained.Conclusion：From the perspective of network pharmacology，the mechanism of Baicalin in the treatment of pulmonary fibrosis involves multiple targets and signal pathways.These targets and pathways are mainly related to the regulation of inflammation，apoptosis and other physiological and pathological processes related to the treatment of pulmonary fibrosis，which provides a network pharmacology framework for the future research of traditional Chinese medicine.

Keywords Baicalin; Pulmonary fibrosis; Network pharmacology; Inflammation; Apoptosis; Signal pathway; Topological analysis; Enrichment analysis

肺纖維化是以成纖維細胞增殖及大量細胞外基質聚集并伴炎性反應損傷、組織結構破壞為特征的一大類肺系疾病的終末期改變[1-3]。該疾病可不同程度損害患者呼吸系統的生理功能[4]，病情持續進展，可最終發展為呼吸循環衰竭而危及患者生命[5-6]，目前臨床尚無特效療法，多采用抗炎、抗纖維化等藥物進行治療[7]，近年來采用天然中草藥治療肺纖維化在臨床試實驗研究中均取得較好進展，能發揮出色的治療效果[8]。中醫認為肺纖維化屬“肺痿”“肺痹”“喘”等疾病的范疇[9]，肺熱被認為是其重要病機之一[10-12]，而黃芩作為清肺熱的常用中藥，被廣泛應用于治療肺纖維化的方劑中[13]，如唐斌擎等[14]擬肺纖煎（黨參、黃芩、制半夏、沙參等）在臨床試驗中取得了良好的臨床療效，黃芩苷既是黃芩的主要成分之一[15]，已經被證實能有效改善肺纖維化的氧化應激、炎性反應等[16-17]。

現階段黃芩苷治療肺纖維化效應機制相關的動物研究、細胞研究等仍缺乏系統或整體層面的研究，導致對黃芩苷藥效多靶點作用機制的認識存在一定的差距[18-21]，因此采用網絡藥理學方法從整體的、系統的角度闡述藥物、靶點和疾病之間的關系，直觀地呈現了藥物靶點網絡[22-24]。有助于理解藥物的藥理學及其對生物網絡的影響，并提高臨床療效[25]。本研究利用藥物靶點預測、蛋白質相互作用（PPI）網絡構建、拓撲篩選等網絡藥理學方法，揭示黃芩苷治療肺纖維化的作用機制，明確其藥用價值。為黃芩苷治療肺纖維化藥效機制的定位和產生協同作用的潛在蛋白靶點的確定提供了一種新的研究方法。

1 材料與方法

1.1 黃芩苷靶點預測 黃芩苷結構信息來自NCBI Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和ZINC數據庫（http：//zinc.docking.org/）[26-27]。黃芩苷的吸收、分布、代謝和排泄（adme）篩選標準包括生物利用度（ob）、藥物相似性（dl）、血腦屏障（bbb）等數據來自TCMSP數據庫[28]。在TargetNet數據庫（http：//targetnet.scbdd.com）根據“Lipinski′s rule of five”（MW，AlogP，TPSA，Hdon，and Hacc）對黃芩苷的成藥性進行評分。研究采用2種方法預測黃芩苷的靶點信息。首先，第1部分靶點來自NCBI數據庫，搜索詞包括“baicalin”和“pulmonary fibrosis”。第2部分來源于Pharmmapper數據庫（http：//lilab.ecust.edu.cn/Pharmmapper/），該數據庫旨在通過反向藥效團映射方法識別小分子的潛在靶點[29]，將黃芩苷的MOL2文件上傳到web服務器中，選擇了“Human Protein Targets Only database”。

1.2 肺纖維化相關靶點收集及PPI網絡建立 研究在DiseaseGene Network數據庫（http：//www.disgenet.org/）[30]、DrugBank數據庫（https：//www.drugbank.ca/）[31]、搜索與“pulmonary fibrosis”相關的疾病靶點。基于收集的肺纖維化相關靶點，在STRING數據庫（https：//string-db.org/）建立PPI網絡[32]，作為基因映射的背景網絡。

1.3 黃芩苷治療肺纖維化預測靶點的基因映射提取及PPI網絡建立 在Cytoscape軟件將黃芩苷化合物的靶點映射在肺纖維化疾病靶點的PPI背景網絡上，提取黃芩苷治療肺纖維化的預測靶點，進一步將黃芩苷治療肺纖維化的預測靶點在STRING數據建立PPI網絡[32]，選擇具有高置信度的PPI進一步研究（low confidence：score<0.4;medium：0.4～0.7;high：>0.7）。

1.4 拓撲分析與富集分析 1）拓撲分析：在Cytoscape軟件對獲取的黃芩苷治療肺纖維化的相關靶點，計算3個拓撲性質“Degree”“Closeness Centrality”和“Betweenness Centrality，選取3個指標均大于中位數的靶點[33]，篩選出具有拓撲重要性的“Hub”節點，定義為黃芩苷治療肺纖維化的核心靶點。2）富集分析：在DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）[34]數據庫進行富集分析，包括生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）及作用通路。選取P<0.05的分析結果，定義為黃芩苷治療肺纖維化的相關作用通路，及生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）;選取P<0.01，FDR<1的分析結果，定義為黃芩苷治療肺纖維化的核心作用通路，及生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）。基于收集獲得的黃芩苷治療肺纖維化的預測靶點，在KEGG數據庫[35]搜索并建立核心通路的路線圖，標注通路內的預測作用靶點。

1.5 黃芩苷治療肺纖維化“靶點-通路”網絡建立 基于收集獲得的黃芩苷治療肺纖維化的預測靶點，及DAVID數據庫進行通路富集分析的黃芩苷治療肺纖維化的核心通路，在Cytoscape軟件建立黃芩苷治療肺纖維化的“靶點-通路”網絡。

2 結果

2.1 黃芩苷成藥性檢驗 在TCMSP收集了黃芩苷（PubChem CID：64982）的ADME數據從而測定黃芩苷的潛在藥物性質，如人OB、DL等，包括MW=446.39，OB（%）=40.12，DL=0.75，BBB=-1.74，黃芩苷的DL計算為0.75，表明黃芩苷與已知藥物相似，此外黃芩苷MW<500 da，alogp<5，DL>0.18，OB>30%，BBB>0.3。

2.2 黃芩苷及肺纖維化靶點數據集建立及基因映射 1）黃芩苷靶點收集及PPI網絡建立：基于在NCBI數據庫及Pharmmapper數據庫收集的黃芩苷靶點，刪除重復靶點后，共收集獲得了黃芩苷的332個不重復的潛在人類蛋白質靶點，這些靶點來自7 302個藥效團模型。在STRING數據庫建立黃芩苷的PPI網絡，獲得了一個332個節點、1 678條邊的PPI網絡（Low Confidence：score<0.4），如圖2。2）肺纖維化靶點收集及PPI網絡建立：在Disease Gene Network和DrugBank數據庫共收集獲得了肺纖維化的431個預測靶點。在STRING數據庫建立肺纖維化的PPI網絡，獲得了一個431個節點、6 216條邊的PPI網絡（Low Confidence：score<0.4）。見圖3。3）基因映射：在Cytoscape軟件中，將黃芩苷332個預測靶點映射在以肺纖維化PPI網絡為背景的網絡上。見圖4。獲得了黃芩苷治療肺纖維化的45個預測靶點。

2.3 黃芩苷治療肺纖維化預測靶點的PPI網絡建立 基于收集獲得的45個黃芩苷治療肺纖維化的預測靶點，建立PPI網絡獲得了1個45個節點、430條邊的PPI網絡，選擇高置信度PPI獲得了1個45個節點、191條邊的PPI網絡。見圖5。

2.4 黃芩苷治療肺纖維化預測靶點拓撲分析、富集分析結果及“靶點-通路”網絡建立 對收集獲得的黃芩苷治療肺纖維化的45個靶點進行拓撲分析，“Degree”中位數為14，“Closeness Centrality”中位數為0.622 641 51，“Betweenness Centrality”中位數為0.002 303 49，其中“Degree”“Closeness Centrality”和“Betweenness Centrality”均大于中位數的具有重要拓撲意義的節點共21個，即為“Hub”節點，為黃芩苷治療肺纖維化的核心靶點。對收集獲得的黃芩苷治療肺纖維化的45個靶點進行富集分析，P<0.05的富集分析結果，包括145個生物過程（BP），16個細胞成分（CC），26個分子功能（MF），21個相關作用通路。其中P<0.01，FDR<0.01的富集分析結果，包括20個生物過程（BP），4個細胞成分（CC），4個分子功能（MF），及3個核心作用通路。基于富集分析結果，建立了黃芩苷治療肺纖維化的“靶點-通路”網絡圖。見圖6。基于在KEGG建立的3個核心作用通路的可視化通路網絡圖，建立黃芩苷治療肺纖維化的可視化通路網絡圖。見圖7。

3 討論

肺纖維化是一種進行性、不可治愈的間質性肺病[36]，目前治療肺纖維化的方法很少。傳統中草藥在肺纖維化治療中具有顯著的療效優勢，然而天然中草藥物多靶點、多途徑的藥效、方效特點阻礙了對其作用機制的深入研究，網絡藥理學提供了一種在系統水平上闡釋黃芩苷生物學機制的研究方法。

首先根據Lipinski規則和ADME參數驗證了黃芩苷良好的成藥性。在NCBI、TCMSP、Pharmmapper、DiseaseGene Network、DrugBank數據庫，分別獲得了黃芩苷的332個靶點及肺纖維化的431個靶點。研究進一步通過建立PPI網絡及基因映射、拓撲分析，獲得了黃芩苷治療肺纖維化的45個預測靶點及21個具有拓撲重要性的靶點。富集分析結果表明，黃芩苷治療急性牙周炎主要圍繞3條核心作用通路，涉及的20個生物過程（BP），4個細胞成分（CC），4個分子功能（MF）。

目前已有的研究表明，黃芩苷具有顯著的抗凋亡、抗氧化和抗炎作用[37-38]，研究顯示黃芩苷治療肺纖維化可以通過作用于與炎性反應密切相關通路TNF signaling pathway、MAPK signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway的上游啟動靶點如TNF、EGF、IL1等[39-40]，從而介導與PI3K-Akt signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、VEGF signaling pathway等多條通路間的復雜交互作用，如Luo L等[41]研究表明NOD-like receptor signaling pathway與MAPK signaling pathway的交互作用在PKC的激活[42]、誘導型一氧化氮的合成[43]、炎性反應升高[44]中均具有重要作用。而“Hub”節點IL6、IL1β、TNF等又構成了這些信號通路復雜交互作用形成的下游組分，其中IL6、IL1β、TNF均是調控介導炎性反應的炎性反應因子釋放的重要靶點[45]。此外還可以作用于PI3K-Akt signaling pathway的“Hub”節點AKT從而調節下游包括凋亡、細胞周期、細胞增殖等多種生物過程[46]。

有趣的是，研究顯示黃芩苷治療肺纖維化還涉及了膠原蛋白分解代謝及平滑肌細胞增殖過程[47-49]，這在成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化過程中具有重要的作用，研究表明靶向肌成纖維細胞分化的藥物是肺纖維化重要的潛在治療方法[50]，“Hub”節點TGF-β1則是調節肌成纖維細胞分化最重要靶點之一[51]，如肌成纖維細胞分化是由TGF-β1誘導的[52-54]。此外，TGF-β1誘導細胞外基質蛋白和收縮性平滑肌蛋白的產生，如α-SMA[55-56]，基質蛋白的表達增加和肌成纖維細胞的收縮特性增強，導致肺纖維化患者進行性限制性肺病和彌漫性損傷，因此抑制這些細胞過程可以減輕肺纖維化的進展。

研究結果表明，黃芩苷通過多個靶點和信號通路及相關通路間的復雜交互作用調節炎性反應、凋亡及成纖維細胞分化等多個過程實現對肺纖維化的治療。

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