冠心病心絞痛氣滯血瘀證和氣虛血瘀證血清中氨基酸代謝組學研究

楊小芳 王茹 何鵬彬

摘要 目的：利用液相-質譜聯用技術的代謝組學方法研究冠心病心絞痛氣滯血瘀證和氣虛血瘀證患者血清中氨基酸內源性代謝物的變化。方法：選取2018年3月至2019年2月中國中醫科學院西苑醫院收治的穩定型冠心病心絞痛患者60例作為研究對象，其中包括氣滯血瘀證30例和氣虛血瘀證30例，以及對照組30例，以液相-質譜聯用為技術平臺，通過多反應監測掃描模式，檢測血清樣本中20種氨基酸含量，同時進行偏最小二乘法判別分析及差異代謝物的分析。結果：根據PLS-DA圖顯示對照組與冠心病不同證型之間氨基酸代謝輪廓明顯不同，其中冠心病組纈氨酸、組氨酸、鳥氨酸等多種氨基酸較對照組含量升高，而γ-氨基丁酸與谷氨酰胺含量降低。氣滯血瘀組和氣虛血瘀組的差異代謝物主要有組氨酸，瓜氨酸等，且2種證型中氣虛血瘀組中含量較高。結論：冠心病心絞痛氣滯血瘀證和氣虛血瘀證中的氨基酸代謝機制紊亂，為區分冠心病中醫證型提供了一定的科學依據。

關鍵詞 代謝組學;氨基酸;冠心病心絞痛;氣滯血瘀證;氣虛血瘀證

Abstract Objective：To study the changes of amino acid endogenous metabolites in the serum of patients with qi stagnation and blood stasis syndrome（QS），qi deficiency and blood stasis syndrome（QD）of coronary heart disease（CHD）with angina pectoris using LC-MS.Methods：A total of 60 patients with stable coronary heart disease and angina pectoris admitted to Xiyuan Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences from March 2018 to February 2019 were selected，including 30 patients with qi stagnation and blood stasis syndrome，30 patients with qi deficiency and blood stasis syndrome，and 30 patients in the control group.Using LC-MS as the technology platform，the multi-reaction monitoring scanning mode was used to detect the content of 20 amino acids in serum samples，and the partial least squares discriminant analysis and differential metabolite analysis were also performed.Results：According to the PLS-DA，the amino acid metabolism profile between the control group and different syndromes of CHD was completely different.The contents of valine，histidine，ornithine and other multiple amino acids in the group of patients with CHD were significantly higher than the control group，while the content of γ-aminobutyric acid and glutamine decreased.Differential metabolites mainly include histidine，citrulline，etc.in and QS and blood stasis group and QD and blood stasis group，with QD containing the more.Conclusion：The amino acid metabolism in patients with CHD and angina pectoris QS and blood stasis and QD syndrome and blood stasis was disordered which provided a scientific basis for distinguishing TCM syndromes of CHD.

Keywords Metabolomics; Amino acids; Coronary heart disease angina pectoris; Qi stagnation and blood stasis syndrome; Qi deficiency and blood stasis syndrome

據流行病學研究分析，冠心病是危害人類身體健康的主要疾病之一，其發病年齡日漸年輕化，發病率總體呈持續上升趨勢[1]。《中國心血管病報告2018》概要揭示，心血管病死亡率居首位，高于腫瘤及其他疾病，占居民病死的40%以上[2]。中醫在治療冠心病方面積累了豐富的經驗，而冠心病中醫分型又以血瘀證為多，約占70%[3]，由于各證型之間常互兼夾，臨床的辨證論治則難度較大。代謝組學研究具有整體、動態、綜合與分析的特點，能夠從代謝網絡終端表象的整體角度反映生物體的功能水平，與中醫學的系統觀、整體觀相近[4]。靶向代謝組學的發展使得我們更清楚的看到某一類代謝物的變化情況。內源性小分子氨基酸與心血管疾病有重要的聯系[5]，因此本研究基于實驗室前期氨基酸靶向代謝組學的研究成果[6]，開展了穩定型冠心病心絞痛氣滯血瘀合氣虛血瘀患者的血清中靶向20種氨基酸的定量研究，從內源性小分子氨基酸水平上探討其機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年3月至2019年2月中國中醫科學院西苑醫院收治的穩定型冠心病心絞痛患者60例作為研究對象。對照組經普通體檢及實驗室檢查排除肝腎、心腦血管等疾病的健康志愿者，對照組中男17例，女13例，年齡48～75歲，平均年齡（60.3±1.0）歲;氣滯血瘀組中男16例，女14例，年齡44～75歲，平均年齡（61.9±1.4）歲;氣虛血瘀組中男16例，女14例，年齡48～74歲，平均年齡（63.3±1.3）歲。3組之間年齡、性別差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。受試者于空腹抽取肘靜脈血置于真空采血管中，4 ℃下3 000 r/min（離心半徑81 mm）離心10 min，取上層血清，并置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 診斷標準 1）西醫診斷標準：參考國際心臟病學會和協會及世界衛生組織臨床命名標準化聯合專題組報告《缺血性心臟病的命名及診斷標準》[7]及歐洲心臟病學會2013年發布的《歐洲心臟病學會穩定型冠狀動脈疾病管理指南》[8]。2）中醫診斷標準：疾病及證型診斷參照中國中醫藥管理局制定的《2014版各科診療方案》中的“胸痹心痛病”（慢性穩定型心絞痛）中醫診療方案。

1.3 納入標準 住院患者，年齡在40～75歲之間;經冠狀動脈造影檢查，符合穩定性冠心病心絞痛診斷者;中醫辨證為氣滯血瘀證、氣虛血瘀證的患者;患者自愿簽訂知情同意書者。

1.4 排除標準 血壓控制不良患者、嚴重糖尿病代謝綜合征患者;患有嚴重慢性心力衰竭、嚴重心律失常或安裝有心臟起搏器、心肌梗死病史的患者;患者有活動性消化道潰瘍和其他出血性疾病的存在;患有惡性腫瘤，自身免疫性疾病或血液疾病患者。

1.5 研究方法

1.5.1 儀器與試劑 Waters超高效液相-三重四級桿質譜儀（美國waters公司，型號：XEVO TQ-S）;乙腈及甲酸（美國fisher公司，貨號：A456-4和A113-50）;甲酸銨（美國Sigma公司，貨號：70221）;甘氨酸（貨號：G8898）、β-丙氨酸（貨號：146064）、丙氨酸（貨號：A7627）、γ-氨基丁酸（貨號：A2129）、絲氨酸（貨號：S4500）、纈氨酸（貨號：855987）、蘇氨酸（貨號：T8625）、牛磺酸（貨號：T0625）、亮氨酸（貨號：L8000）、異亮氨酸（貨號：I2752）、反式-羥脯氨酸（貨號：56250）、天冬酰胺（貨號：A0884）、鳥氨酸（貨號：W419001）、賴氨酸（貨號：L5501）、甲硫氨酸（貨號：M9625）、苯丙氨酸（貨號：P1751）、1-甲基-組氨酸（貨號：67520）、瓜氨酸（貨號：C7629）、色氨酸（貨號：T0254）均購于美國sigma公司;谷氨酰胺（貨號：A0784）、組氨酸（貨號：A0698）購于日本TCI公司;氨基酸內標（貨號：NSK-1）購自于美國CIL（Cambridge Isotope Laboratories）公司，其中該內標包含11種同位素氨基酸;超純水為Milli-Q system超純水純化系統。

1.5.2 對照品溶液的制備 精密稱取上述氨基酸對照品1 mg置1.5 mL的EP管中，溶解得到1 mg/mL的標準溶液，搖勻放入4 ℃冰箱備用。

1.5.3 血液樣本的處理 將血清放置4 ℃冰箱解凍，振蕩混合均勻，取樣4 μL裝于1.5 mL的離心管中，然后加入991 μL提取液及5 μL內標液（NSK-1內標液稀釋50倍），渦旋混合1 min，4 ℃下12 000 r/min（r=84 mm）離心5 min，取上清液于進樣小瓶內待測[5]。

1.5.4 色譜條件 超高效液相色譜ACQUITY BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相A：乙腈（含0.2%甲酸和1 mmol甲酸銨）;流動相B：超純水（含0.1%甲酸和1 mmol甲酸銨）;梯度洗脫：（0.0 min，85%A;5.5 min，80%A;12.5 min，60%A;13.5 min，85%A;15 min，85%A），柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量5 μL。

1.5.5 質譜條件 Waters三重四級桿質譜（TQ-S）儀：采用正離子模式多反應監測進行采集;毛細管電壓為0.4 KV;錐孔電壓為20 V。離子源溫度為150 ℃;去溶劑氣溫度為400 ℃;去溶劑氣流量為800 L/h;錐孔氣流量為150 L/h。各氨基酸對應的母子離子對，錐孔電壓及碰撞能量以發表。數據分析利用MassLynx V 4.1對采集得到的譜圖進行離子對的積分等操作。

1.6 統計學方法 將得到的積分數據進行統計學分析，每一行代表一個樣本，每一列代表一種化合物，數值即為此化合物在樣本中的含量。以Excel形式保存，用于模式識別分析。將其Excel導入至SIMCA-P軟件（13.0）進行建模判別分析，模式識別采用偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）。之后將測得的20種靶向氨基酸進行方差分析（P<0.05認為差異有統計學意義），找出顯著性差異的代謝差異物，從內源性小分子氨基酸水平上探討其機制。

2 結果

2.1 標準曲線與線性范圍 將氨基酸類標準儲備液（1 mg/L）用配制的提取液稀釋配制成標準溶液系列，線性范圍見表1，在上述儀器條件下分析。各氨基酸與內標物的峰面積比值（Y）為縱坐標，以濃度（pg/μL）為橫坐標（X）進行線性回歸，得到標準曲線，線性關系良好，回歸方程和相關系數見表1。以3倍信噪比（S/N）估算方法檢測限，以10倍信噪比（S/N）估算方法定量限，結果見表1。

2.2 氣滯血瘀證與氣虛血瘀證患者血樣氨基酸代謝組學研究 為了更清楚的表達氨基酸內源性代謝輪廓，偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）方法能夠很好的解決無監督分析中組間差異不明晰的問題，從PLS-DA圖（圖1）中可以看出圖中的每一個點代表一個樣本，患有穩定型心絞痛的冠心病患者的代謝狀態與對照組的代謝狀態明顯不同，冠心病心絞痛氣滯血瘀證和氣虛血瘀證氨基酸代謝輪廓也存在明顯不同，再對其血樣中的含量進行統計學分析。由表2可以看出，對照組，氣滯血瘀組與氣虛血瘀組患者體內氨基酸的含量變化情況，大多數氨基酸在冠心病心絞痛患者血清中含量較高，且有顯著性差異（組氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸、亮氨酸、纈氨酸、β-丙氨酸、1-甲基-組氨酸、瓜氨酸），2種氨基酸（谷氨酰胺、γ-氨基丁酸）較對照組降低，且差異有統計學意義。見圖2。本研究根據不同證型氨基酸代謝物的變化來闡明中醫“證候”的調節機制。所有采集的數據對不同證型的代謝標志物進行區分，從靶標代謝組學研究篩查出與心力衰竭相關氨基酸小分子標志物分析研究，涉及到上述氨基酸代謝通路，說明冠心病心絞痛患者的氨基酸代謝是紊亂的，同時不同證型的氨基酸代謝通路機制上也存在一定差異。

3 討論

本研究利用LC-MS技術對冠心病氣滯血瘀證及氣虛血瘀證患者的血清樣本進行氨基酸代謝組學分析，探索2種證型血清中20種氨基酸的代謝情況。發現冠心病血清樣本中組氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸、亮氨酸、纈氨酸、β-丙氨酸、1-甲基-組氨酸較對照組含量升高，谷氨酰胺、γ-氨基丁酸較對照組降低。在心肌受損的情況下，ATP合成減少，心肌耗氧量增加。支鏈氨基酸中的亮氨酸與纈氨酸均可轉化成糖和脂質，為機體提供能量[9]。因此，這些代謝物含量升高是為了適應機體的應急反應。組氨酸可以在組氨酸脫羧酶的催化下生成組胺，過多的組胺可誘發冠脈收縮，冠脈血流減少，加重心肌缺血[10]。甲硫氨酸增加會導致內皮功能受損、血管舒縮功能減弱，增加冠心病發病的風險[11]。甲硫氨酸通過轉硫作用生成牛磺酸，牛磺酸含量顯著升高[12]。冠心病患者機體代謝發生障礙，鳥氨酸循環被激活，導致尿素及鳥氨酸積累。瓜氨酸是從鳥氨酸及胺基甲醯磷酸鹽在尿素循環中生成，因此鳥氨酸的增加導致瓜氨酸含量也顯著增加。而生糖氨基酸谷氨酰胺可通過谷氨酰胺異化轉化成糖，為機體提供能量[13]。丙氨酸升高使無氧代謝增強，造成ATP合成減少[14]。γ-氨基丁酸能夠擴張血管，防止動脈硬化等作用，冠心病患者血樣中γ-氨基丁酸含量顯著降低。甘氨酸在絲氨酸經甲基轉移酶的催化下，由絲氨酸合成，甘氨酸含量降低[15]，提示絲氨酸合成甘氨酸的過程受到阻礙，造成絲氨酸含量的積累。2種證型之間的差異物主要為組氨酸及瓜氨酸，且氣虛血瘀證升高的更為明顯，提示冠心病心絞痛氣滯血瘀及氣虛血瘀患者機制主要相關是組氨酸和瓜氨酸的代謝通路上，為更好區別兩證型還需要進一步的其他類別內源性小分子的差異分析。

參考文獻

[1]Zhao LL，Wan L，Qiu XJ，et al.A Metabonomics Profiling Study on Phlegm Syndrome and Blood-Stasis Syndrome in Coronary Heart Disease Patients Using Liquid Chromatography/Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2014，2014：1-10.

[2]胡盛壽，高潤霖，劉力生，等.《中國心血管病報告2018》概要[J].中國循環雜志，2019，34（3）：209-220.

[3]Li S，Zhang Z，Wu L，et al.Understanding Zheng in traditional Chinese medicine in the context of neuro-endocrine-immune network[J].IET system biology，2007，1（1）：51-60.

[4]Hu CX，Xu GW.Metabolomics and traditional Chinese medicine[J].Trends in Analytical Chemistry，2014，61：207-214.

[5]Oberkersch RE，Santoro MM.Role of amino acid metabolism in angiogenesis[J].Vascul Pharmacol，2019，112：17-23.

[6]Guo N，Yang DW，Yang XF，et al.A rapid，sensitive and widely applicable method for quantitative analysis of underivatized amino acids in different biological matrices by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Separation Science，2019，42（20）：3173-3181.

[7]國際心臟病學會和協會及世界衛生組織臨床命名標準聯合專題組.缺血性心臟病的命名及診斷標準[J].中華心血管病雜志，1981，9（1）：75-78.

[8]Task Force Members.2013 ESC guidelines on the management of stable coronary artery disease：theTask Force on the management of stable coronary artery disease of the European Society of Cardiology[J].Eur Heart J，2013，34（38）：2949-3003.

[9]Grajeda-Iglesias C，Aviram M.Specific Amino Acids Affect Cardiovascular Diseases and Atherogenesis via Protection against Macrophage Foam Cell Formation：Review Article[J].Rambam Maimonides Medical Journal，2018，9（3）：1-11.

[10]周耀中，楊濤，季雪峰，等.基于UHPLC/MS的冠心病心絞痛血瘀證患者血清代謝組學研究[J].江蘇中醫藥，2018，50（6）：25-28.

[11]段俊麗，李月，王一塵，等.過量服用蛋氨酸所致高同型半胱氨酸血癥對缺血性血管新生的抑制作用[J].中國動脈硬化雜志，2003，11（6）：493-497.

[12]Shi Q，Zhao H，Chen J，et al.Study on Qi Deficiency Syndrome Identification Modes of Coronary Heart Disease Based on Metabolomic Biomarkers[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2014，2014：1-15.

[13]張詠萍，孔璟，吳嘉燕，等.大鼠慢性心衰致死的代謝特征與標記物研究[J].中國法醫學雜志，2018，33（4）：329-334.

[14]華何與，崔凱，關山越，等.不穩定型心絞痛氣滯血瘀證與痰濁痹阻證的血漿代謝組學研究[J].光明中醫，2013，28（10）：2037-2040.

[15]簡維雄，肇凱，黃獻平，等.冠心病心血瘀阻證血漿代謝組學的檢測分析[J].中國中西醫結合雜志，2010，30（6）：579-584.