補腎益髓方及其拆方調控實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠軸突再生抑制信號通路相關分子的實驗研究

王 蕾 安 辰 趙 暉 薛 冰 齊 放 李君玲 金良韻 張 楠 樊永平

(1.首都醫科大學中醫藥學院中醫臨床方藥學系 中醫絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069；2.首都醫科大學中心實驗室，北京 100069；3.首都醫科大學附屬北京天壇醫院中醫科，北京 100070)

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經系統(central nervous system，CNS)自身免疫反應介導的炎性神經退行性病變[1-2]，研究[3]顯示，軸突缺損是MS患者持續性神經功能障礙的主要原因。因此，促進軸突再生也是治療MS的重要環節[4]。目前西醫采用免疫治療(如激素、干擾素等)以控制其炎性反應，減輕軸突損傷，但長期大量使用，不良反應明顯[5]。現代醫學對神經再生修復方面仍無安全有效的方法。補腎益髓方(Bushen Yisui formula，BSYSF)是首都醫科大學附屬北京天壇醫院中醫科樊永平教授研發的一首治療MS的有效方劑，并開發為膠囊制劑。本方具有補腎兼化痰活血之功，前期研究[6-8]顯示，BSYSF能顯著改善MS患者的臨床癥狀，提高患者的生活質量。本方對MS的動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠也具有明顯的神經保護作用，并能促進神經再生[9-12]，但其促進軸突再生的作用機制仍不清楚。大量的研究表明，軸突損傷后神經再生抑制因子增多是阻礙軸突再生的重要因素之一[13]，NogoA是具有較強抑制作用的因子，含有66個氨基酸殘基組成的胞外結構域[14-15]，NgR是Nogo-66的主要受體，表達于軸突和神經元表面[16]，并且能與p75/TROY-LINGO-1形成受體復合物，將信號傳入細胞，從而導致RhoA及其下游分子Rho相關激酶(Rho-associated kinase, ROCK)的活化[17]。其中ROCKⅡ主要在腦及脊髓中表達，這些分子激活后引起肌球蛋白解聚、微絲等細胞骨架重排，從而導致神經突起回縮及生長錐塌陷[18-19]。本實驗在前期研究的基礎上，利用EAE小鼠模型，采用實時熒光定量-PCR(quantitative real time-PCR，qRT-PCR)技術檢測小鼠腦和脊髓中神經再生抑制因子NogoA/NgR及其信號通路RhoA/ROCK mRNA表達，同時結合免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)及蛋白質印跡(Western blotting, WB)法測定上述因子蛋白表達，深入探討BSYSF及其拆方補腎方(Bushen formula，BSF)和化痰活血方(Huatan Huoxue formula，HTHXF)促進軸突再生的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8周齡SPF級C57BL/6雌性小鼠，體質量15～17 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK(京)2012-0001，在首都醫科大學實驗動物中心飼養。小鼠飼置于恒溫(18 ℃～22 ℃)恒濕(40%～60%)的單籠獨立通風系統中，自由飲食喂養1周后進行實驗研究。所有實驗步驟均經首都醫科大學動物實驗及實驗動物福利委員會審核批準。

1.2 藥物及試劑

BSYSF(生地黃、熟地黃、制何首烏、浙貝母、益母草、全蝎、水蛭、天麻、連翹、酒大黃)及其拆方BSF(生地黃、熟地黃、制何首烏)和HTHXF(浙貝母、益母草、全蝎、水蛭、天麻、連翹、酒大黃)均由中國北京亞東生物制藥有限公司制備，其簡要的制備方法為：以上除浙貝母外的9味中藥煎煮濃縮成稠膏，再將浙貝母研粉加入到膏中混勻備用。醋酸潑尼松片(prednisone acetate，PA)由中國天津力生制藥有限公司生產；梓醇(catapol，CA)購于中國杭州康木科技有限公司。

髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein35-55，MOG35-55)純度>98%，由中國北京旭和源生物科技有限公司合成；百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)購自美國Sigma公司(貨號：P7208)；結核分枝桿菌(tuberculosis mycobacterium, TB)購自美國Difco公司(貨號：231141)；完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)購自美國Sigma公司(貨號：F5881)；NogoA抗體(貨號：ab62024)、NgR抗體(貨號：ab26291)、ROCKⅡ抗體(貨號：ab125025)均購自于英國Abcam公司；RhoA抗體(貨號：2117S)購自德國CST公司。

1.3 EAE小鼠模型制備

將MOG35-55、CFA和TB混合，在20 mL注射器內反復抽推1 h，制成油包水乳劑，MOG為50 μg/只，TB為0.4 mg/只，用0.9%(質量分數)氯化鈉注射液配制。分別于第0天及第7天給每只造模小鼠背部四點皮下注射0.2 mL抗原乳劑，在第0及第2天分別腹腔注射500 ng PTX。

1.4 分組及給藥

將小鼠按照數字表法隨機分為7組：正常對照(normal control，NC)、模型(model，MO)、PA、CA、BSYSF、BSF和HTHXF組,每組16只。免疫當天開始給予小鼠相應藥物灌胃，PA劑量為6 mg/kg，CA為40 mg/kg，BSYSF、BSF和HTHXF分別為生藥3.02、1.44和1.57 g /kg。NC及MO組小鼠以等量蒸餾水替代。1次/d，連續40 d。

1.5 取材及處理

在發病第25天(急性期)和第40天(緩解期)，選取4只小鼠10%(質量分數)水合氯醛(190 mg/kg)腹腔注射麻醉，4%(質量分數)多聚甲醛心臟灌流，取腦和脊髓，并置于4%(質量分數)多聚甲醛中固定1周。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，以2 μm厚度連續切片用于IHC測定；選取4只小鼠快速取出大腦及脊髓，置于液氮中，之后放置于-80 ℃冰箱保存，用于qRT-PCR和WB檢測。

1.6 檢測指標

1.6.1 qRT-PCR測定小鼠腦和脊髓中NogoA/NgR/RhoA/ROCKⅡmRNA的表達

取小鼠大腦及脊髓30～50 mg，根據RNA Prep Pure動物組織總RNA提取試劑盒(貨號：DP431，中國天根生化科技有限公司)的說明提取總RNA。用Molecular Devices酶標儀(型號：SpectraMax Plus 384型，美國 Molecular Devices公司)檢測總RNA的濃度和純度，取A260/A280在1.8～2.2的RNA樣品做下一步實驗，RNA的完整性通過凝膠電泳來確定。根據TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號：KR104，中國天根生化科技有限公司)進行反轉錄。引物由TaKaRa公司設計并合成，引物序列詳見表1。擴增反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共循環40次，4 ℃保存。以β-actin基因為內參對照，用2-△△Ct表示基因相對表達量。

表1 各指標引物序列

1.6.2 IHC法測定小鼠腦和脊髓中NogoA/NgR/RhoA/ROCKⅡ蛋白的表達

小鼠腦和脊髓切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇洗脫至水，磷酸鹽緩沖液沖洗，微波抗原修復后，用3%(體積分數)H3O3室溫孵育10 min。滴加一抗稀釋液NogoA(腦1∶200，脊髓1∶350)、NgR(腦1∶300，脊髓1∶350)、RhoA(1∶300)和ROCKⅡ(腦1∶100，脊髓1∶200)，4 ℃孵育過夜，37 ℃復溫1 h，依次加入二抗試劑，置于37 ℃下孵育，DAB顯色，脫水，透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡(型號：CX23型，中國北京銳馳恒業儀器有限公司)每張切片隨機選取5個不重疊視野觀察照相，并通過NIS-Elements BR 3.2軟件測定積分吸光度(absorbance，A)值。

1.6.3 WB法測定小鼠腦和脊髓中NogoA/NgR/RhoA/ROCKⅡ蛋白的表達

提取小鼠大腦及脊髓組織蛋白，按BCA法進行蛋白定量，取21 μg蛋白樣品進行10%(質量分數)SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，300 mA電轉60 min，麗春紅染色，5 % (質量分數)脫脂奶粉封閉1 h，加入NogoA(1∶20 000)、NgR(1∶5 000)、RhoA(腦1∶20 000，脊髓1∶5 000)、ROCKⅡ(1∶5 000)和GAPDH(1∶20 000)一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶20 000)，搖床室溫孵育90 min，于暗室進行膠片曝光、顯影和定影。通過Image J圖像分析系統測定各蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白條帶與內參GAPDH條帶比值表示。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 BSYSF及其拆方BSF和HTHXF對小鼠腦和脊髓中NogoA/NgR/RhoA/ROCKⅡmRNA的調節作用

qRT-PCR測定結果顯示，小鼠免疫第25天和第40天，與NC組比較，MO組小鼠腦和脊髓組織中NogoA 和NgR mRNA表達明顯上調(P<0.05，P<0.01)，而各治療組小鼠腦和脊髓NogoA和NgR mRNA 表達較MO組明顯下調(P<0.05，P<0.01)。詳見表2，3。

表2 各組小鼠腦及脊髓中NogoA mRNA的表達變化

GroupNumber of caseBrainSpinal cordDay 25Day 40Day 25Day 40NC40.84±0.170.83±0.130.64±0.200.64±0.26MO41.60±0.12*1.87±0.10*1.58±0.28*1.60±0.28*PA40.95±0.13#0.88±0.27#0.72±0.27#0.68±0.25#CA40.96±0.19#0.84±0.15#0.74±0.27#0.71±0.26#BSYSF40.87±0.12#0.84±0.26#0.73±0.25#0.65±0.18#BSF40.88±0.11#0.85±0.08#0.74±0.22#0.73±0.22#HTHXF40.96±0.18#0.86±0.25#0.73±0.21#0.71±0.25# NC: normal control; MO:model; PA:prednisone acetate; CA:catapol; BSYSF:Bushen Yisui Formula; BSF:Bushen formula; HTHXF:Huatan Huoxue formula; *P<0.05 vs NC group;#P<0.05 vs MO group.

表3 各組小鼠腦及脊髓中NgR mRNA的表達變化

GroupNumber of caseBrainSpinal cordDay 25Day 40Day 25Day 40NC40.44±0.100.44±0.110.79±0.060.79±0.03MO41.34±0.30**1.85±0.57*1.14±0.10*1.15±0.10*PA40.48±0.07#0.67±0.21#0.86±0.05#0.81±0.01#CA40.61±0.08#0.73±0.28#0.84±0.06#0.80±0.05#BSYSF40.45±0.03##0.50±0.10#0.87±0.04#0.80±0.09#BSF40.59±0.02#0.50±0.08#0.85±0.11#0.82±0.09#HTHXF40.63±0.11#0.65±0.24#0.86±0.03#0.82±0.09# NC: normal control; MO: model; PA: prednisone acetate; CA: catapol; BSYSF: Bushen Yisui formula; BSF: Bushen formula; HTHXF: Huatan Huoxue formula; *P<0.05, **P<0.01 vs NC group;#P<0.05, ##P<0.01 vs MO group.

如表4所示，MO組小鼠腦中RhoA和ROCKⅡ mRNA表達也明顯上調(P<0.05，P<0.01)。各治療組小鼠腦RhoA mRNA表達較MO組均有不同程度的下調，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。但在小鼠脊髓中，與MO組比較，只有PA與BSYSF組小鼠RhoA mRNA表達明顯下調(P<0.01)。免疫第25天和第40天，與NC組比較，MO組小鼠腦與脊髓中ROCK Ⅱ mRNA表達明顯上調(P<0.05，P<0.01)。各治療組ROCK Ⅱ mRNA表達較MO組均有不同程度的明顯下調(P<0.05，P<0.01)。詳見表5。

表4 各組小鼠腦及脊髓中RhoA mRNA的表達變化

GroupNumber of caseBrainSpinal cordDay 25Day 40Day 25Day 40NC40.81±0.030.81±0.090.83±0.100.83±0.12MO41.32±0.06*1.31±0.15*1.01±0.101.08±0.16PA40.81±0.02#0.81±0.13#0.27±0.01##0.32±0.11##CA40.86±0.03#0.87±0.05#0.62±0.150.56±0.01BSYSF40.82±0.15#0.84±0.01#0.29±0.03##0.30±0.05##BSF40.85±0.11#0.85±0.02#0.55±0.160.78±0.18HTHXF40.88±0.04#0.85±0.08#0.59±0.150.78±0.16 NC: normal control; MO: model; PA: prednisone acetate; CA: catapol; BSYSF: Bushen Yisui formula; BSF: Bushen formula; HTHXF: Huatan Huoxue formula;*P<0.05 vs NC group;#P<0.05, ##P<0.01 vs MO group.

表5 各組小鼠腦及脊髓中ROCKⅡ mRNA的表達變化

GroupNumber of caseBrainSpinal cordDay 25Day 40Day 25Day 40NC40.87±0.060.87±0.100.87±0.070.87±0.05MO41.24±0.12**1.22±0.11*1.23±0.09*1.25±0.10**PA40.93±0.03#0.88±0.07##0.80±0.08##0.89±0.01#CA40.95±0.04#0.95±0.04#0.93±0.10#0.91±0.09#BSYSF40.87±0.02##0.88±0.02##0.76±0.08##0.85±0.05##BSF40.97±0.04#0.95±0.04#0.92±0.02#0.91±0.08#HTHXF40.99±0.07#0.96±0.07#0.94±0.02#0.91±0.05# NC: normal control; MO: model; PA: prednisone acetate; CA: catapol; BSYSF: Bushen Yisui formula; BSF: Bushen formula; HTHXF: Huatan Huoxue formula; *P<0.05, **P<0.01 vs NC group;#P<0.05, ##P<0.01 vs MO group.

2.2 BSYSF及其拆方BSF和HTHXF對小鼠腦和脊髓中NogoA/NgR/RhoA/ROCK Ⅱ免疫病理的調節作用

IHC測定結果顯示，發病第25天和第40天，MO組小鼠腦和脊髓中NogoA、NgR、RhoA和ROCK Ⅱ表達較NC組明顯升高(P<0.01，P<0.001)，各治療組小鼠腦和脊髓中上述指標的蛋白表達與MO組相比均有明顯下降(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。詳見圖1～8及表6～9。

圖1 各組小鼠腦中NogoA表達變化

圖2 各組小鼠脊髓中NogoA的表達變化

圖3 各組小鼠腦中NgR的表達變化

圖4 各組小鼠脊髓中NgR的表達變化

圖5 各組小鼠腦中RhoA的表達變化

圖6 各組小鼠脊髓中RhoA的表達變化

圖7 各組小鼠腦中ROCK Ⅱ的表達變化

圖8 各組小鼠脊髓中ROCKⅡ的表達變化

表6 各組小鼠腦及脊髓中NogoA的表達變化

表7 各組小鼠腦及脊髓中NgR的表達變化

GroupNumber of caseBrainSpinal cordDay 25Day 40Day 25Day 40NC415.07±1.9516.40±1.0721.20±0.9722.70±1.36MO432.98±1.76***24.06±1.48**30.06±1.18***27.79±1.31**PA423.89±1.75##18.29±1.05#24.06±1.51#23.13±1.83#CA424.21±1.85##18.34±1.59#24.06±1.28#23.59±1.49#BSYSF416.17±1.31###17.98±1.66##21.13±1.45###22.11±1.26##BSF426.58±1.60#18.03±1.26#24.51±1.45#22.99±1.14#HTHXF426.02±1.66#18.54±1.57#25.30±1.47#23.27±1.44# NC: normal control; MO: model; PA: prednisone acetate; CA: catapol; BSYSF: Bushen Yisui formula; BSF: Bushen formula; HTHXF: Huatan Huoxue formula; **P<0.01, ***P<0.001 vs NC group;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs MO group.

表8 各組小鼠腦及脊髓中RhoA的表達變化

GroupNumber of caseBrainSpinal cordDay 25Day 40Day 25Day 40NC421.47±2.3225.07±1.5626.29±3.1720.31±1.97MO444.36±3.59***34.38±1.80***41.93±2.76**28.82±2.02**PA432.85±3.05#28.42±1.87#31.00±3.09#23.52±1.72#CA434.89±2.73#26.18±2.01#30.57±3.72#23.21±1.89#BSYSF425.27±3.68###25.12±1.47##26.53±2.15##20.32±1.76##BSF427.76±3.82##26.15±1.55#26.56±3.75##22.00±1.66#HTHXF435.03±3.13#27.86±1.74#30.56±1.80#22.83±1.53# NC: normal control; MO: model; PA: prednisone acetate; CA: catapol; BSYSF: Bushen Yisui formula; BSF: Bushen formula; HTHXF: Huatan Huoxue formula;**P<0.01, ***P<0.001 vs NC group;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs MO group.

表9 各組小鼠腦及脊髓中ROCKⅡ的表達變化

GroupNumber of caseBrainSpinal cordDay 25Day 40Day 25Day 40NC421.27±1.6822.07±1.6421.28±2.3921.61±1.20MO439.14±1.25**31.49±1.42*39.44±3.83*34.81±2.648*PA426.90±1.75###25.05±2.20#21.55±3.67##22.16±2.73##CA431.02±1.77##23.55±1.24#27.06±2.92#26.65±2.79#BSYSF427.76±1.56###23.09±2.70#22.78±2.02##24.52±2.63#BSF427.78±1.27###24.03±2.29#22.81±3.52##24.69±2.76#HTHXF434.22±1.59#25.19±1.76#28.94±3.63#27.06±2.32# NC: normal control; MO: model; PA: prednisone acetate; CA: catapol; BSYSF: Bushen Yisui formula; BSF: Bushen formula; HTHXF: Huatan Huoxue formula; *P<0.05, **P<0.01 vs NC group;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs MO group.

2.3 BSYSF及其拆方BSF和HTHXF對小鼠腦和脊髓中NogoA/NgR/RhoA/ROCKⅡ蛋白的調節作用

WB測定結果顯示，免疫第25天和第40天，MO組小鼠腦和脊髓NogoA和NgR表達較NC組明顯升高(P<0.01)，各治療組NogoA和NgR表達與MO組相比，均有明顯下調(P<0.05、P<0.01),差異均有統計學意義。詳見圖9，10。

圖9 各組小鼠腦和脊髓中NogoA蛋白的表達變化

圖10 各組小鼠腦和脊髓中NgR蛋白的表達變化

圖11，12所示，免疫第25天和第40天，MO組小鼠腦和脊髓RhoA和ROCKⅡ蛋白表達較NC組明顯升高(P<0.05，P<0.01)，BSYSF降低RhoA明顯(P<0.05)，差異有統計學意義；BSF在第25天下調小鼠腦RhoA明顯(P<0.05)在第25天和40天下調小鼠脊髓RhoA明顯(P<0.05)，差異有統計學意義；其他差異無統計學意義。經各組藥物治療后，ROCKⅡ蛋白均有明顯降低(P<0.05，P<0.01)，差異有統計學意義。

圖11 各組小鼠腦和脊髓中RhoA蛋白的表達變化

圖12 各組小鼠腦和脊髓中ROCKⅡ蛋白的表達變化

3 討論

前期研究[9-10]證實，補腎益髓方對EAE動物具有明顯的防治作用。本方能夠明顯降低EAE小鼠發病率，減輕腦和脊髓炎性反應，降低EAE小鼠的神經評分，對神經具有保護作用。為了進一步研究補腎益髓方中補腎和化痰活血兩大治法的不同配伍作用，將其拆方為補腎方及化痰活血方進行分析。體外細胞實驗[20]顯示，補腎益髓方及拆方補腎和化痰活血含藥血清能升高低血清培養的SH-SY5Y細胞生存率，促進其軸突生長，尤以補腎益髓方作用明顯。動物實驗結果[11-12]顯示，補腎益髓方及其拆方補腎和化痰活血方能夠通過下調β-淀粉樣前體蛋白和硫酸軟骨素蛋白多糖，上調神經絲蛋白200和微管相關蛋白-2以減輕軸突損傷和促進軸突再生。但其作用機制有待深入探討。由于醋酸潑尼松是目前治療MS的一線藥物[5]，梓醇是本方中君藥生地黃中有代表性的活性成分,具有促進神經再生等作用[21-22]。因此，本實驗以醋酸潑尼松和梓醇為陽性對照，利用EAE小鼠模型，從調節軸突再生抑制因子信號通路方面深入探討補腎益髓方及其拆方的作用機制。

研究[23]顯示，NogoA/NgR及其軸突生長抑制通路與MS/EAE密切相關，如MS患者脫髓鞘病變慢性活動區可見NogoA和NgR表達的升高。用抗NogoA特異性抗體接種動物可以有效阻斷NogoA表達，有利于保護并修復神經元損傷[24]。NgR阻滯劑可以明顯減輕EAE模型動物的軸突損傷程度[25]。MS/EAE病程中RhoA/ROCK信號通路的激活，啟動了磷酸化/去磷酸化效應，使細胞骨架出現重排，從而影響神經突起的形成。大量研究[26]顯示，RhoA、ROCK在MS和EAE模型動物腦和脊髓組織中RhoA和ROCK呈現高表達。在體和離體實驗均顯示，用ROCK抑制劑能阻滯Rho/ROCK信號通路活化，可明顯改善EAE模型動物神經功能缺損癥狀，延緩病程，促進神經細胞軸突再生[27]。本次實驗結果顯示，EAE小鼠腦和脊髓抑制因子NogoA/NgR及其信號通路分子RhoA/ROCKⅡmRNA和蛋白表達均明顯升高，推測其原因主要與軸突、髓鞘損傷后NogoA、NgR等抑制因子大量產生，進而啟動抑制信號通路有關。而經補腎益髓方及其拆方補腎和化痰活血方處理后，急性期和緩解期EAE小鼠腦和脊髓中的上述因子具有不同程度的降低，說明補腎益髓方及其拆方均可通過抑制NogoA/NgR/RhoA/ROCK起到促進軸突再生的作用，且在趨勢上以補腎益髓方最為顯著，而補腎和化痰活血方在下調脊髓RhoA mRNA表達方面的作用不明顯；另外，補腎方在降低緩解期EAE小鼠腦脊髓RhoA蛋白(WB法)作用不明顯，同時，化痰活血方對急性期、緩解期EAE小鼠腦和脊髓的RhoA蛋白(WB法)均無顯著的調節作用，提示拆方單獨使用對上述因子起到部分調節作用，但二者配伍所成補腎益髓方全方集相輔相成之功，能夠顯著抑制上述因子表達，發揮促進軸突再生的作用明顯。

上述結果表明降低神經抑制因子NogoA/NgR及其相關信號通路RhoA/ROCK的表達，可能是補腎益髓方及其拆方治療MS的機制之一。以補腎益髓方顯著，補腎方次之，化痰活血方不及前兩方，提示補腎配伍化痰活血法可加強對信號通路分子的調節作用，從而明顯促進軸突修復。