包載多西他賽的聚合物膠束抑制小鼠乳腺癌轉移作用研究

王愛婷 鄢 丹 齊憲榮

(1. 首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院藥劑科，北京 100038；2. 臨床合理用藥生物特征譜學評價北京市重點實驗室，北京 100038；3. 北京大學醫學部藥學院藥劑學系，北京 100191)

2019年1月，國家癌癥中心發布的最新一期全國癌癥統計數據[1]顯示，乳腺癌為女性發病首位，每年發病人數約為30.4萬，死亡人數約6.99萬。腫瘤轉移是乳腺癌分期的重要依據之一，也是影響預后的主要因素[2-4]。世界衛生組織(World Health Organization, WHO)[5]認為，早期乳腺癌可以治愈，但仍有20%～30%的乳腺癌患者發展至晚期，IV期乳腺癌5年生存率不到20%。因此，研究抑制乳腺癌轉移的藥物及其制劑具有重要意義。

目前，腫瘤治療常采用手術聯合化學藥物治療和放射治療的治療方案，但這種方法常伴隨嚴重的不良反應，且常因腫瘤轉移的出現使得治療效果不佳[6]。納米給藥系統的興起與快速發展，為腫瘤治療提供了更多選擇。納米給藥系統可通過系統本身的物理化學性質和包載的造影劑或治療藥物發揮多重的診斷和治療功能：通過實體瘤的高通透性和滯留(enhanced permeability and retention, EPR)效應在腫瘤組織蓄積，即實現被動靶向功能；亦可通過腫瘤特異性配體修飾實現主動靶向作用。此外，納米給藥系統可被設計為特異性刺激響應型，如pH、缺氧、酶等內源性刺激響應或光、磁場、超聲等物理性刺激響應。轉移瘤與原位實體瘤不同的是，轉移瘤初始體積微小且相對缺乏血管使得納米給藥系統很難通過EPR效應發揮被動靶向，這給腫瘤轉移的治療帶來了巨大挑戰。然而，不斷地有更多新型納米給藥系統被設計用于腫瘤轉移的治療[7]。

除腫瘤轉移外，腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)也嚴重影響腫瘤患者的治療效果和預后。有研究[8]表明，腫瘤多藥耐藥和腫瘤轉移存在相關性。如與腫瘤多藥耐藥相關的基因P糖蛋白被發現在轉移腫瘤中高度表達；MDR相關蛋白(multidrug resistance related protein, MRP)、CD44的高表達也與腫瘤表現出較強的侵襲轉移能力相關。

本課題組前期構建的含TPGS1000的包載多西他賽的聚合物膠束具有逆轉腫瘤多藥耐藥的作用[9-10]。因此，本研究將進一步考察該聚合物膠束抑制乳腺癌轉移的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多西他賽(docetaxel, DTX)購自北京諾瑞醫藥技術有限公司；甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-methoxy(polyethylene-glycol)2000, DSPE-mPEG2000]購自日本油脂株式會社(NOF)；聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(TPGS1000)購自美國Sigma-Aldrich公司；泰索帝?(Taxotere?)購自賽諾菲-萬安特(上海)制藥有限公司；0.25%(質量分數)胰酶、雙抗(含青霉素100 U/mL和鏈霉素100 mg/L)、RPMI 1640培養基購自北京中科邁晨科技有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；D-Luciferin購自美國Santa Cruz公司；Bouin’s溶液購自北京雷根生物技術有限公司。

螢火蟲熒光素酶標記的小鼠乳腺癌細胞(4T1/Luc)購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。培養液為RPMI 1640+10%(體積分數)胎牛血清+1%(體積分數) 雙抗，培養于37 ℃、5% (體積分數)CO2環境中，消化液為0.25%(質量分數)胰酶+0.02% (質量分數)EDTA。雌性Balb/c小白鼠，體質量15～16 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0006、北京大學醫學部實驗動物部飼養。所有動物實驗均按照北京大學動物實驗的指導原則進行。

1.2 聚合物膠束制備與性質評價

薄膜水化法制備包載多西他賽的普通膠束(以DSPE-mPEG2000為脂材，藥物和脂材質量比為1∶30，簡稱DM)和含TPGS1000的膠束(以DSPE-mPEG2000和TPGS1000為脂材，脂材質量比為1∶1，藥物和脂材質量比為1∶30，簡稱TDM)[7]。

采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)測定膠束包封率、載藥量；采用激光散射納米粒度儀測定膠束的粒徑和zeta電位。HPLC條件：色譜柱為Diamonsil C18 (250 mm×46 mm, 5 μm)；洗脫條件為等濃度洗脫；流動相為乙腈∶水=57∶43，總流速為1 mL/min；進樣量為20 μL；檢測條件為紫外檢測器230 nm波長。包封率和載藥量計算公式如下：

包封率=過濾膜膠束稀釋樣品中DTX濃度/未過濾膜膠束稀釋樣品中DTX濃度×100%

載藥量=膠束中DTX量/(膠束中DTX量+脂材加入量)×100%

采用透射電鏡對聚合物膠束結構進行表征。將制備的載藥膠束稀釋至適當倍數，滴于銅網上，干燥后以1%(質量分數)醋酸雙氧鈾負染，透射電子顯微鏡觀察。

1.3 4T1/Luc 細胞的體外生物發光活性鑒定

將4T1/Luc細胞進行倍比稀釋于96孔板中，細胞數目依次為100 000、50 000、25 000、12 500個，每孔加入100 μL的細胞液，每個細胞濃度設置3個復孔，并以無血清RPMI 1640培養基作為對照。測定前10～15 min，每孔加入200 μL熒光素酶底物D-Luciferin(150 mg/L)，將測量板置于活體生物發光成像儀中，檢測各孔細胞的發光強度。

1.4 轉移模型的建立

4T1/Luc細胞培養至對數生長周期后，胰酶消化收集細胞，用無血清培養基重懸細胞，得到1×107個/mL的細胞混懸液，取0.1 mL通過尾靜脈注射到小鼠體內[7,11]。

1.5 預防腫瘤轉移效果評價

將通過尾靜脈接種了4T1/Luc細胞的小鼠采用數字表法隨機分為4組，每組6只，接種當天記為第0天。另外以未接種腫瘤細胞的小鼠作為對照(Control組)。實驗組小鼠于第1、4、7天分別尾靜脈注射0.2 mL的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液(Model組)、泰索帝(Taxotere?)、DM、TDM，DTX給藥劑量為10 mg/kg。第9天時，記錄體質量后處死動物，剝離肺組織，肺部稱質量后置于12孔板中且用熒光素酶底物D-Luciferin溶液(300 mg/L)浸泡，隨即將測量板置于活體生物發光成像儀中進行生物發光成像。成像結束，PBS清洗后將肺組織浸泡在Bouin’s溶液中，24 h后拍照成像。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 聚合物膠束性質評價

制備的兩種聚合物膠束(DM和TDM)溶液無色、澄清透明。如圖1和表1所示，兩種聚合物膠束呈現球狀，粒徑約20 nm，帶弱負電荷，包封率大于85%，載藥量約3%。與DM相比，TDM具有更小的粒徑、更高的包封率和載藥量。

圖1 包載多西他賽的聚合物膠束形態表征

表1 包載多西他賽的聚合物膠束性質評價

**P<0.01vsDM group.DM:docetaxel-loaded micelles with DSPE-mPEG2000as lipid materials;TDM:docetaxel-loaded micelles with both DSPE-mPEG2000and TPGS1000as lipid materials.

2.2 4T1/Luc 細胞的體外生物發光活性鑒定

不同濃度的4T1/Luc細胞體外生物發光成像如圖2所示。結果顯示，對照組無明顯生物發光，說明該實驗條件下培養基等對生物發光性質的測定沒有干擾。4T1/Luc細胞體外生物發光性質良好，且在一定細胞數量范圍內生物發光強度與細胞數目成正比。

圖2 不同濃度的4T1/Luc細胞體外生物發光檢測

2.3 預防腫瘤轉移效果評價

臟器系數可評價動物臟器病變的性質和程度。不同制劑給藥組小鼠肺臟器系數如圖3所示，未注射腫瘤細胞的正常小鼠肺臟器系數為0.78%±0.05%，該值與文獻[12]報道一致。與正常小鼠相比，接種腫瘤細胞的肺轉移模型小鼠肺臟器系數顯著增加，為1.72%±0.42%。Taxotere?、DM、TDM治療后可降低模型小鼠肺臟器系數，分別為1.54%±0.26%、1.17%±0.16%和0.94%±0.10%。

圖3 不同制劑給藥組小鼠肺臟器系數

將離體的小鼠肺浸泡在熒光素酶底物D-Luciferin溶液中，立即進行離體組織的生物發光成像并對生物發光進行半定量分析，結果如圖4A、B所示。正常組小鼠肺組織幾乎無自發生物發光，注射腫瘤細胞的模型組小鼠肺部生物發光最強，說明該組肺部腫瘤細胞最多，各制劑治療后肺部生物發光有不同程度下降，說明各制劑對小鼠乳腺癌肺轉移有抑制作用。TDM組抑制小鼠乳腺癌肺轉移作用最強。

各組小鼠肺組織經Bouin’s溶液固定后照片如圖4C所示。對照組小鼠肺組織表面光滑，無腫瘤結節；注射腫瘤細胞的模型組小鼠肺組織表面結節密集；各制劑治療組小鼠肺組織表面結節數量減少，其中，TDM組肺組織表面相對光滑，腫瘤結節數最少，呈現與對照組最為接近的表面形態，說明TDM組抑制小鼠乳腺癌肺轉移作用最強。

圖4 不同制劑給藥組小鼠肺轉移情況

3 討論

本研究制備的兩種聚合物膠束(以DSPE-mPEG2000為脂材的載多西他賽聚合物膠束DM，以DSPE-mPEG2000和TPGS1000質量比為1∶1的載多西他賽聚合物膠束TDM)粒徑約為20 nm，含TPGS1000的TDM有更小的粒徑，可能與TPGS1000的親水鏈為PEG1000有關。該粒徑范圍的聚合物膠束在體循環中可逃避單核巨噬細胞系統、網狀內皮系統和腎小球濾過作用的清除[13-14]，也可避免發生加速血液消除現象[15-16]，因此可更長時間、更多數量地存在于血液循環。腫瘤部位血管呈現高滲透性，該粒徑的膠束可通過EPR效應被動靶向至腫瘤部位[17]，為進一步穿透并蓄積到腫瘤內部提供先決條件。兩種聚合物膠束呈現弱負電性，可避免與血漿蛋白結合，進而避免被巨噬細胞吞噬。同時，帶負電性的膠束也可跨越表面負電性的血管與細胞的排斥，順利進入細胞[18]。膠束包封率和載藥量可滿足體內給藥需求。與DM相比，TDM包封率和載藥量均有提升，是由于TPGS1000的疏水端為體積較大、表面積較大的維生素E琥珀酸酯，使得TPGS1000與疏水性藥物的相互作用更強，因而當以TPGS1000作為部分脂材構建膠束時，可增加包封率[19]。

臟器系數可評價動物臟器病變的性質和程度。正常狀態的動物臟器系數差別不大。臟器系數增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；臟器系數減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。本研究中正常小鼠肺臟器系數為0.78%±0.05%，肺轉移模型小鼠臟器系數顯著增加，說明肺部病變程度高。各制劑治療組可降低模型小鼠肺臟器系數，其中TDM組最小且與正常小鼠組最為接近，說明TDM組小鼠肺組織病變程度最低，從一定程度上反映了TDM組有更好地抑制小鼠乳腺癌肺轉移作用。

生物發光是基于熒光素酶能催化底物化學發光的原理，將體外能穩定表達熒光素酶的細胞株植入動物體內，與后期注射入體內的底物發生反應，利用光學系統檢測光強度，間接反映出細胞數量的變化或細胞的定位。這項技術已被廣泛應用于多個領域，如腫瘤或疾病動物模型的建立、病毒學研究、siRNA 研究、干細胞研究、蛋白質相互作用研究等。螢火蟲熒光素酶/D-Luciferin是一對常用的熒光素酶/底物，發光原理為：在ATP、O2存在時，螢火蟲熒光素酶催化D-Luciferin氧化脫羧自發發光，該體系不需要激發光，具有較高靈敏性且生物發光強度與標記細胞數量成正比[20-21]。本研究中不同濃度的4T1/Luc細胞體外生物發光性質良好，且發光強度與細胞數目成正比，為后續研究各制劑對小鼠肺組織轉移抑制作用提供了方法基礎。離體的肺組織體外生物發光強度可間接反映肺部腫瘤數量。各制劑治療后可降低模型小鼠肺組織生物發光強度，其中，TDM組生物發光強度最低。

肺部轉移的腫瘤結節數目也可作為抑制肺轉移效果的評價指標[22]。Bouin’s固定液可用于維持細胞和組織的原有形態，經Bouin’s固定液固定的肺組織更易觀察表面腫瘤結節[23]。模型組小鼠肺部表面結節數量最多，說明小鼠肺轉移模型構建成功。各制劑治療后可降低模型小鼠肺部結節數量，使肺組織表面更加光滑，其中TDM組肺部腫瘤結節最少。

綜上，肺部臟器系數、生物發光成像、生物發光半定量和表面腫瘤結節數目均呈現較為一致的結果，即TDM組有最強的抑制小鼠乳腺癌肺轉移作用。可能是DTX與TPGS1000共同發揮促進腫瘤細胞凋亡的結果。