反流性食管炎治療效果與食管下段菌群構成變化的關系研究

余 英 高 峰 張 杰

(首都醫科大學附屬北京安貞醫院消化內科，北京 100029)

腸道中微生物的數量超過食管、胃微生物總和的10個數量級[1-2]，食管中的細菌不易被成功檢測到，但隨著基因檢測技術的不斷發展，特別是宏基因組學與高通量測序分析相結合，在食管黏膜中存在的微生物方面取得了突破，食管黏膜也是人體微生物定植的場所之一，也具有復雜的微生物構成[3-4]。很多食管疾病都與胃食管反流以及胃食管反流相關食管微環境及黏膜微生物構成改變相關[5-8]。本研究通過分析對比質子泵抑制劑治療8周前后食管下段黏膜菌群構成變化與療效的關系，探尋食管黏膜菌群變化在反流性食管炎進展及預后中的作用，預測反流性食管炎患者的轉歸。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年5月至2018年10月在首都醫科大學附屬北京安貞醫院就診并行胃鏡檢查診斷反流性食管炎的患者為研究對象，根據治療8周后食管黏膜愈合情況分為愈合組和愈合不良組。愈合組定義為內鏡下表現食管黏膜正常，病理提示正常食管鱗狀上皮；愈合不良組定義為內鏡下表現食管黏膜未完全愈合，仍有食管黏膜損傷。其中愈合組22例，男性13例，女性9例，平均年齡(49.9±14.8)歲，未愈合組10例，男性7例，女性3例，平均年齡(53.1±15.3)歲,所有納入的受試者需簽署知情同意書，并取得受試者基本健康信息。本研究課題經首都醫科大學附屬北京安貞醫院倫理委員會批準，倫理審批號:2017052X，符合臨床試驗倫理要求。

1)納入標準：胃鏡下診斷證實為反流性食管炎的患者，符合反流性食管炎洛杉磯分型[9]A、B、C、D四級中的一級；食管黏膜組織學檢查符合反流性食管炎的病理表現。

2)排除標準：①不能配合檢查及治療的患者；②患有其他慢性疾病者(慢性阻塞性肺疾病、慢性心功能不全、慢性腎功能不全、糖尿病等)；③患有其他消化道疾病者(炎性反應性腸病、消化性潰瘍、消化道良性、惡性腫瘤等)；④近1個月內接受過以下藥物治療的患者(a.微生態制劑；b.抗生素；c. 質子泵抑制劑(proton pump inhibitor,PPI)和 H2受體拮抗劑；d.免疫抑制劑、細胞毒制劑；e.激素類等)；⑤C13呼氣試驗結果陽性，診斷幽門螺桿菌感染的患者；⑥正參加其他臨床試驗的患者。

3)退出標準：①受試期間出現嚴重不良反應，包括藥物過敏、藥物不耐受、內鏡的嚴重合并癥；②受試期間未按要求完成規范化的藥物治療方案；③在受試期間接受了其他影響胃內菌群的藥物；④受試者主動提出退出本研究。

1.2 研究方法

所有患者給予質子泵抑制劑規范治療8周(艾司奧美拉唑腸溶片20 mg口服，每日1次，早餐前30 min服用, 阿斯利康醫藥科技有限公司)，研究者每周對入選的反流性食管炎患者進行隨訪，記錄癥狀改善情況、不良反應、藥物使用情況。符合退出標準的將被退出本研究。

采用自身對照試驗研究，比較反流性食管炎患者治療前及口服質子泵抑制劑治療8周后食管下段黏膜菌群構成的變化。治療前記錄受試者性別、年齡、身高、體質量、吸煙、飲酒及胃食管反流病量表評分(Gastroesophageal Reflux Disease Questionnaire，GERDQ)等臨床資料，行胃鏡檢查并于食管下段齒狀線以上2 cm處取黏膜組織2塊，然后受試者接受規范化治療8周，療程結束后再次記錄GERDQ評分，復查胃鏡再次于食管下段黏膜齒狀線以上2 cm處取組織2塊。每次采集的2塊黏膜組織標本分別用于病理診斷及菌群檢測。

1.3 菌群分析

使用DNA提取試劑盒提取和純化食管黏膜組織樣本獲得細菌總DNA并進行質量檢測，操作和檢測步驟均按照試劑盒說明書進行。將檢測合格的黏膜微生物DNA樣本對其指定區域進行PCR擴增、文庫制備、文庫質檢、定量，通過Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺對檢測合格的文庫進行測序，應用微生物群落定量分析(Quantitative Insights Into Microbial Ecology,QIIME)系統進行歸類分析。使用生物信息學分析軟件進行菌群構成多樣性、菌群相關性分析。本研究中所有樣本的菌群構成檢測及生物信息學分析均由中國科學院微生物研究所完成。

1.4 統計學方法

2 結果

本研究共隨訪了41例反流性食管炎患者，其中7例因違背治療方案(4例未按規范服用質子泵抑制劑，2例在治療過程中因患其他疾病口服抗生素治療，1例在治療過程中因患其他疾病口服益生菌制劑)，符合退出標準被退出本研究，2例失訪，最終32例反流性食管炎受試者入選本研究。愈合組GERDQ評分中位數9分，體質量指數中位數為25.4 kg/m2，吸煙率27.2%，飲酒率31.8%; 未愈合組GERDQ評分中位數8分，體質量指數中位數為26.2 kg/m2，吸煙率50%，飲酒率40%。兩組間上述指標比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，詳見表1。

反流性食管炎患者在質子泵抑制劑規范治療前及治療后菌群構成的主要菌門都是厚壁菌門，放線菌門，擬桿菌門和變形桿菌門，占總細菌數的98%以上。反流性食管炎黏膜愈合組、愈合不良組兩組在治療前菌群構成比較,門、綱、目、科、屬水平差異均無統計學意義 (P>0.05)。治療8周后兩組在屬水平菌群構成差異有統計學意義，黏膜愈合不良組雙歧桿菌屬、螺桿菌屬低于黏膜愈合組(P=0.003、P=0.014)，但在門、綱、目、科水平差異無統計學意義(P>0.05,表2)。

表1 反流性食管炎愈合組與愈合不良組患者臨床資料對比

ItemsHealing group(n=22)Poor healing group(n=10)StatisticsPAge/a49.9 ± 14.853.1 ± 15.30.552*0.581Gender(male/female)13/97/30.349#0.703GERDQ Before treatment9.0(8.0-11.0)8.0(8.0-9.25)-1.662△0.119 After treatment6.0(6.0-6.0)7.0(6.0-8.25)-1.855△0.100BMI/(kg·m2)25.4(22.7-27.2)26.2(22.5-28.3)-0.570△0.589Smoking(smoking/no smoking)6/165/51.574#0.252Drinking(drinking/no drinking)7/154/60.204#0.703

*tvalue；#χ2value;△Zvalue;GERDQ: Gastroesophageal Reflux Disease Questionnaire;BMI: body mass index.

表2 反流性食管炎愈合組、愈合不良組治療前、后的菌群屬水平構成比較

反流性食管炎愈合不良組治療前、后菌群構成在門、綱、目、科、屬水平差異均無統計學意義 (P>0.05)。愈合組治療前、后菌群構成在門、綱、目水平差異無統計學意義 (P>0.05)，在科水平及屬水平，治療后乳桿菌科高于治療前(P=0.001)，治療后乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、螺桿菌屬高于治療前(P=0.001，P=0.042，P=0.049)(表3)。

表3 反流性食管炎愈合組治療前、后菌群科及屬水平構成比較

3 討論

本研究將反流性食管炎愈合組與愈合不良組兩組治療前食管黏膜的炎性反應情況按照嚴重程度進行比較，愈合組22例患者中有6例是重度食管炎，愈合不良組10例患者中有3例是重度食管炎，愈合組與愈合不良組兩組比較，治療前食管炎的嚴重程度差異無統計學意義(P= 0.874)，排除了反流性食管炎嚴重程度不同導致愈合程度不同的假設。除此之外，在初始治療前，對每一位患者進行健康宣教，告訴他們飲食生活上的注意事項以及藥物的正確服用方法，并且在每周的隨訪過程中詳細詢問飲食、生活情況，以及藥物服用情況，盡量排除不良生活方式以及藥物使用不當對食管黏膜愈合的影響。

食管疾病的發生與食管黏膜菌群構成密切相關。隨著基因檢測技術的進步，對于食管菌群的認識不斷更新。研究[9-10]顯示食管微生物有一部分來自于口腔吞咽，口腔中的菌群和食管、胃黏膜的菌群存在一定的相似性，后來的基因序列分析也證實了這一點，從口腔中獲得的樣本(包括舌頭、頰黏膜、硬腭和軟腭、牙齦斑)和食管黏膜樣本中檢測出的菌群有140多種細菌物種是相同的；另外胃內細菌也可能反流入食管，但是食道下括約肌有助于減少胃內容物及胃內細菌的反流進入到食管腔。但隨著深入的分子研究發現有一些口咽的常見細菌(如螺旋菌、脫鐵桿菌等)并未在食管黏膜中被發現，另外食管除了來源于口咽吞咽及胃內反流的細菌外還有其他一些細菌。通過食管黏膜活檢樣本的顯微鏡檢查顯示存在多種細菌(包括革蘭陽性和革蘭陰性桿菌、球菌和球桿菌)，這些細菌與食管上皮細胞結合緊密, 提示這些細菌是長期定植于食管黏膜中, 而非瞬時感染，通過連續洗脫過的黏膜樣品中細菌仍然存在，進一步表明細菌與黏膜密切結合在一起。

本研究中反流性食管炎愈合組、愈合不良組治療前的菌群構成在門、綱、目、科、屬水平差異均無統計學意義(P>0.05)，但是經過質子泵抑制劑規范治療8周后愈合組、愈合不良組兩組菌群構成差異有統計學意義，在屬水平愈合組雙歧桿菌屬、螺桿菌屬豐度高于愈合不良組。反流性食管炎愈合不良組治療前與治療后自身對照菌群構成差異無統計學意義(P>0.05)，但是愈合組治療前與治療后自身對照菌群構成差異有統計學意義(P<0.05)，愈合組食管下段黏膜中的乳桿菌科、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、螺桿菌屬豐度治療后均高于治療前。

雙歧桿菌和乳桿菌均是人體有益菌，其對人體微生態產生有益作用的機制包括：通過參與合成多種酶、氨基酸和維生素，起到營養作用；具有免疫調節特性，保護宿主免受感染及其產生的異常炎性反應的影響；通過各種機制來增強黏膜屏障功能[11-14]。因此雙歧桿菌、乳桿菌制劑已經作為益生菌被廣泛應用到多種疾病的治療中。

本研究中食管愈合組雙歧桿菌屬、乳桿菌科及乳桿菌屬含量均增加，雙歧桿菌、乳桿菌對于人體健康的保護作用可能是中國反流性食管炎患病率較低的原因之一，也可能是反流性食管炎患者質子泵抑制劑規范治療后黏膜愈合良好的原因之一。這些有益菌群的增多可能通過抑制致病菌繁殖、抗炎性反應、免疫調節、維持和提高黏膜屏障功能等方面起到保護食管黏膜的作用，但其中的具體機制還需要進一步研究。

除了雙歧桿菌、乳桿菌這兩種有益菌在愈合組中比例增高，本研究還發現螺桿菌屬比例增高。幽門螺桿菌歸類于螺桿菌屬，流行病學研究[15]表明亞洲人幽門螺桿菌感染率較高，幽門螺桿菌對于胃食管反流病的發生有保護作用。在一項以中國人群為基礎的研究[16]中，反流性食管炎發病率與幽門螺桿菌感染呈負相關。最新研究[17]顯示發現胃食管反流病患者中合并幽門螺桿菌感染的那一部分患者食管蠕動增強，食管下括約肌(low esophageal sphincter，LES)壓力升高，食管酸暴露減少，因此幽門螺桿菌感染可能對于胃食管反流病的發生、發展起著保護作用，幽門螺桿菌感染可通過刺激胃底和賁門的迷走神經受體，增加血清胃泌素分泌，從而增強LES壓力，減少胃酸和胃內容物的反流，從而保護食管黏膜。

本研究中反流性食管炎患者治療后愈合組螺桿菌屬高于治療前，愈合不良組治療后螺桿菌屬較治療前沒有明顯變化。本研究納入的所有反流性食管炎受試者均是幽門螺桿菌陰性，因此螺桿菌屬中除了幽門螺桿菌以外的某些其他菌種可能是反流性食管炎的保護因素，在未來的研究中將進一步探索。