奶粉中沙門氏菌檢測(cè)能力驗(yàn)證結(jié)果與分析

柴洪艷 喬璐 陳亮

沙門氏菌在自然界中廣泛存在,易污染水源、食品等,短時(shí)間大量增殖[1,2]。沙門氏菌是北京市乃至全國(guó)食源性疾病的主要致病菌之一。可致敗血癥和腸炎等[3],對(duì)人們身體健康造成危害。能力驗(yàn)證是保證檢測(cè)質(zhì)量必要手段,可以用來評(píng)估檢測(cè)能力[4,5]。2017年底,全國(guó)共431個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加了“2017年國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)網(wǎng)微生物質(zhì)量控制考核暨2017年國(guó)家認(rèn)監(jiān)委能力驗(yàn)證計(jì)劃C類項(xiàng)目-食源性沙門菌檢驗(yàn)分型”。北京鐵路疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室也參與了該項(xiàng)目,共接到3份奶粉樣品,編號(hào)分別為2017S-01(002)-1;2017S-01(002)-2;2017S-01(002)-3,并對(duì)3份樣品進(jìn)行了沙門氏菌檢測(cè)且完成血清學(xué)分型。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備 低溫恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)、VITEK2全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)(法國(guó)梅里埃公司)、生物安全柜(美國(guó)LABCONCO公司)。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、亞硫酸鉍(BS)瓊脂、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂等均購(gòu)自北京君立康科技發(fā)展有限責(zé)任公司和陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;VITEK 2 GN鑒定卡購(gòu)自生物梅里埃公司;沙門氏菌診斷血清購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)。所有培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理：根據(jù)此次考核檢測(cè)要求,將裝有凍干菌的西林瓶于室溫下放置15 min復(fù)溫;無菌操作打開西林瓶,加入1 mL緩沖蛋白胨水(BPW)溶液進(jìn)行復(fù)溶,室溫靜置3 min;充分混懸西林瓶?jī)?nèi)容物,靜置30 s,以消除產(chǎn)生的泡沫。

1.3.2 預(yù)增菌和增菌：將上述溶液轉(zhuǎn)移至含有220 mL滅菌BPW的樣品均質(zhì)袋中,再用滅菌BPW充分洗滌西林瓶?jī)?nèi)壁4次,每次1 mL,洗滌合并到樣品均質(zhì)袋中;向樣品均質(zhì)袋中分別加入相應(yīng)編號(hào)樣品基質(zhì)袋中的基質(zhì),振蕩混勻后,按照GB 4789.4-2016 36℃預(yù)增18 h[6];低溫恒溫培養(yǎng)箱中取出輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過的樣品混合物,移取1mL轉(zhuǎn)種于TTB內(nèi),于(42±1)℃培養(yǎng)24 h。同時(shí),另取1 mL轉(zhuǎn)種于SC內(nèi),于36℃分別培養(yǎng)24 h。

1.3.3 分離：使用一次性接種環(huán)分別取增菌液1環(huán),分別劃線接種于BS瓊脂平板和沙門氏菌顯色培養(yǎng)基,BS瓊脂平板36℃培養(yǎng)48 h,沙門氏菌顯色培養(yǎng)基36℃培養(yǎng)24 h。

1.3.4 生化試驗(yàn)：自選擇瓊脂平板上分別挑取3～5個(gè)可疑菌落接種三糖鐵瓊脂。同時(shí)接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板36℃培養(yǎng)24 h。選取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的純菌落,按VITEK2全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)的要求進(jìn)行上機(jī)鑒定。

1.3.5 血清學(xué)鑒定：將VITEK2全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)和三糖鐵結(jié)果符合沙門氏菌的菌落進(jìn)行血清凝集實(shí)驗(yàn)。首先進(jìn)行生理鹽水對(duì)照,如不凝集再進(jìn)行多價(jià)菌體抗原(O)和多價(jià)鞭毛抗原(H)抗血清的凝集。

1.3.6 結(jié)果判定：根據(jù)選擇性培養(yǎng)基菌落特征、三糖鐵初步生化結(jié)果和VITEK2全自動(dòng)微生物系統(tǒng)生化鑒定結(jié)果以及血清凝集情況進(jìn)行綜合判定。

2 結(jié)果

2.1 分離菌落形態(tài)特征 三份奶粉樣品在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征不同,其中2017S-01(002)-2在BS、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂上均無菌落生長(zhǎng);而2017S-01(002)-1和2017S-01(002)-3均表現(xiàn)為有菌落生長(zhǎng),且特征與沙門氏菌的生長(zhǎng)特征基本相符合(表1),2017S-01(002)-2未檢出沙門氏菌。

表1 分離菌落形態(tài)特征

2.2 三糖鐵反應(yīng)結(jié)果 2017S-01(002)-1考核樣品產(chǎn)酸產(chǎn)堿,產(chǎn)氣產(chǎn)硫化氫,而2017S-01(002)-3考核樣品產(chǎn)酸產(chǎn)堿,不產(chǎn)氣產(chǎn)硫化氫(表2)。

2.3 系統(tǒng)生化鑒定結(jié)果 取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的純菌落進(jìn)行上機(jī)鑒定,其中2017S-01(002)-1和2017S-01(002)-3的VITEK2生化結(jié)果見表3和4。

表2 考核樣品在三糖鐵反應(yīng)結(jié)果

表3 2017S-01(002)-1樣品VITEK2生化結(jié)果

2.4 生化鑒定結(jié)果 從VITEK2全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)生化鑒定結(jié)果看出,其中2017S-01(002)-1鑒定為腸炎沙門菌血清型,2017S-01(002)-3被鑒定為沙門菌群,且符合率均較高,分別為98%和99%。

表4 樣品2017S-01(002)-3 VITEK2生化結(jié)果

2.5 血清凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2017S-01(002)-1和2017S-01(002)-3血清凝集情況不同,生理鹽水均不凝集,其中2017S-01(002)-1菌體抗原O4,12、O9,12、O9均凝集,O4 不凝集;鞭毛抗原 Hg、Hm、H1,v、H7均凝集,Hv不凝集。其中2017S-01(002)-1菌鞭毛抗原第二相在初始凝集時(shí)不凝集,故作了誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。用已知的第一相血清做H抗原第二相的誘導(dǎo)凝集試驗(yàn),最后第二相凝集。2017S-01(002)-3菌體抗原 O4、O5、O27、O4,12、O9,12 均凝集,O9 不凝集;鞭毛抗原 Hd、H1,v、H1,2,3,5、H2 均凝集,Hv、H5 不凝集(表5)。

表5 血清凝集情況

2.6 鑒定結(jié)果 根據(jù)選擇性培養(yǎng)基、三糖鐵和VITEK2全自動(dòng)微生物系統(tǒng)生化鑒定結(jié)果以及血清凝集情況綜合判定為2017S-01(002)-2未檢出沙門氏菌。 2017S-01(002)-1、2017S-01(002)-3盲樣分別為檢出腸炎沙門氏菌、檢出斯坦利沙門氏菌。

3 討論

3.1 通過能力驗(yàn)證可以提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平,確保結(jié)果的準(zhǔn)確性,同時(shí)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)問題,及時(shí)改進(jìn)糾正[7,8]。沙門菌屬血清型別較多,對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)水平和經(jīng)驗(yàn)有較高的要求[9]。此次能力驗(yàn)證三份奶粉樣品檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)100%,與指定菌一致,能力驗(yàn)證結(jié)果滿意,驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)室沙門氏菌的檢驗(yàn)?zāi)芰Α?/p>

3.2 此次沙門氏菌能力驗(yàn)證表明,在打開樣品進(jìn)行初步分離時(shí),必須按能力驗(yàn)證要求操作,這與相關(guān)報(bào)道一致[10]。首先在室溫放置幾分鐘,其次加入的初次增菌液的次數(shù)按要求加入,且反復(fù)吹打,盡量使西林瓶?jī)?nèi)的所有細(xì)菌都洗脫下來,有時(shí)能力驗(yàn)證所含細(xì)菌量少,如果不按此步操作,很容易造成細(xì)菌漏檢。

3.3 GB4789.4-2016 5.3中要求劃線接種BS平板和XLD平板(或HE平板或沙門顯色培養(yǎng)基),3種平板可以自選其一。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基菌落特征明顯,容易識(shí)別[11],可直接對(duì)菌落進(jìn)行初篩[12,13]。使檢測(cè)者根據(jù)顏色特征能初步判定結(jié)果方向,可基本排除與沙門氏菌屬特征相近的其他細(xì)菌,提高檢測(cè)效率。此次能力驗(yàn)證試驗(yàn)提示沙門氏菌顯色培養(yǎng)基優(yōu)于XLD和HE培養(yǎng)基。

3.4 此次能力驗(yàn)證中,2017S-01(002)-1號(hào)奶粉樣本通過VITEK2全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為腸炎沙門菌血清型,但在實(shí)際工作中必須按照國(guó)標(biāo)方法要求進(jìn)行血清凝集試驗(yàn),綜合菌落特征、三糖鐵、生化結(jié)果才能最終判定檢驗(yàn)結(jié)果。

3.5 沙門氏菌血清凝集時(shí)難點(diǎn)在H抗原的第二相誘導(dǎo)[14],此次沙門氏菌的能力驗(yàn)證,在血清凝集部分,做了誘導(dǎo)試驗(yàn)。傳統(tǒng)的方法是使用瓊脂粉,用水溶解后再高壓滅菌,制成平板或U型管,且每次需要現(xiàn)用現(xiàn)配,過程繁瑣。本次能力驗(yàn)證為了適應(yīng)實(shí)際需要,改進(jìn)了原有的半固體瓊脂的配制方法,將儲(chǔ)備的營(yíng)養(yǎng)瓊脂和營(yíng)養(yǎng)肉湯煮沸冷卻至50℃左右,使用無菌大試管,分別加入4 mL、5 mL、6 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂,再加入營(yíng)養(yǎng)肉湯至20 mL,制成不同濃度的半固體瓊脂溶液,倒入平板,凝固后進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn),此次能力驗(yàn)證菌株在加入6 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂的比例濃度中誘導(dǎo)情況最好。此方法不僅簡(jiǎn)單便于操作,更能根據(jù)不同沙門氏菌的菌株特點(diǎn),多制備幾個(gè)濃度,以免半固體瓊脂平板太軟或太硬影響凝集效果,能夠盡可能早出具檢測(cè)報(bào)告。另外要從蔓延生長(zhǎng)的菌苔邊緣挑取菌落凝集[15],否則影響凝集效果。