鐵過載對再生障礙性貧血患者外周血淋巴細胞亞群的影響

俞穎 朱琳超 李強 姚軼敏

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是由免疫介導的造血干細胞及造血微環境損傷，從而導致骨髓造血功能衰竭的一種惡性血液疾病，以骨髓造血干細胞增生減低和外周血全血細胞減少為特征，以貧血、出血和感染為主要臨床表現，病死率高。AA患者由于頻繁輸血，使機體鐵沉積量過多，造成鐵過載，導致多種臟器不同程度的損傷，且病程和預后與鐵過載程度相關[1-2]。近年來，鐵過載和免疫系統的關系受到越來越多的關注，免疫因素的介入會加劇鐵過載對人體的危害[3-4]。淋巴細胞是機體免疫系統重要的免疫細胞，研究發現鐵過載可通過升高活性氧（reactive oxygen species，ROS）來調節 T淋巴細胞數量和功能[5]。但關于AA患者鐵過載對淋巴細胞影響的報道尚少，為此筆者回顧性分析AA患者臨床資料和血清鐵蛋白、血常規和淋巴細胞亞群等參數，旨在探討鐵過載對AA患者外周血淋巴細胞亞群的影響及其與鐵過載程度的相關性。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年3月至2019年3月本院門診或住院部收治的AA患者200例作為研究對象，患者均符合《血液病診斷及療效標準》（第3版）中AA診斷標準[6]，所有患者均未經造血干細胞移植治療，臨床和實驗室檢查排除感染性疾病、免疫性疾病、骨髓移植和其他造血系統疾病。以鐵蛋白＞1 000μg/L定義為鐵過載[7]，其中鐵過載、非鐵過載各100例。鐵過載組：男44例，女56 例，年齡 12～84（40.1±16.7）歲；非鐵過載組：男 33例，女 67 例，年齡 9～80（37.7±16.2）歲。160 例健康志愿者作為健康對照組，其中男70例，女90例，年齡16～70（40.7±12.3）歲。3組受檢者性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

1.2 試劑與儀器 Beckman-Coulter Gen.S LH780全自動血液分析儀、血常規配套試劑、Beckman 5色流式細胞儀、單克隆抗體 CD3+、CD4+、CD8+、CD45+、CD19+、CD16+、CD56+試劑盒、Abbott C1600 全自動生化分析儀及配套試劑購自美國Abbott公司。

1.3 方法

1.3.1 血常規檢測 于清晨采集受檢者外周靜脈血2ml，用乙二胺四乙酸二鉀抗凝，使用Beckman-Coulter Gen.S LH780全自動血液分析儀檢測，2h內上機完成。獲得中性粒細胞數、淋巴細胞數、中性粒細胞/淋巴細胞比值（NRL）。

1.3.2 淋巴細胞亞群（T細胞、Treg細胞、Th細胞、Tc細胞、CD4/CD8、B細胞、NK細胞）檢測 血標本6h內染色、上機檢測。取流式管，加入10μl不同熒光標記的單克隆抗體，加入外周血100μl混勻，室溫下避光放置20min，加入溶血素2ml，室溫下放置20min，500g離心6min，棄上清液，加入2ml PBS洗滌，離心，棄上清液，500μl PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群表達，包括CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD3－CD19+、CD3－CD16+CD56+。

1.3.3 血清鐵蛋白檢測 采用Abbott C1600全自動生化分析儀檢測血清鐵蛋白，正常范圍14～233ng/ml。

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用LSD-t法，方差不齊時兩兩比較采用Tamhane法。計數資料組間比較采用χ2檢驗。鐵過載和非鐵過載組淋巴細胞、NRL、T細胞、NK細胞與鐵蛋白之間的相關性分析采用Pearson相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組受檢者血常規檢測結果比較 鐵過載組和非鐵過載組中性粒細胞數、淋巴細胞數、NRL與健康對照組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；鐵過載組淋巴細胞數與非鐵過載組比較降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；鐵過載組NRL與非鐵過載組比較升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表 1。

表1 3組受檢者血常規檢測結果比較

2.2 3組受檢者淋巴細胞亞群檢測結果比較 鐵過載組和非鐵過載組T細胞、Treg細胞、Tc細胞、CD4/CD8、NK細胞比例與健康對照組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；鐵過載組T細胞、NK細胞比例與非鐵過載組比較均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

2.3 鐵過載組與非鐵過載組患者NK細胞與鐵蛋白之間的相關性 鐵過載組NK細胞與鐵蛋白呈負相關（r=-0.617，P＜0.05），非鐵過載組NK細胞與鐵蛋白無相關性（r=0.009，P ＞0.05），見圖 1、2。

表2 3組受檢者淋巴細胞亞群檢測結果比較

圖1 鐵過載組NK細胞與鐵蛋白的散點圖

圖2 非鐵過載組NK細胞與鐵蛋白的散點圖

3 討論

AA是血液系統的常見疾病，目前認為AA的發病機制主要為造血微環境異常、造血干祖細胞缺陷和免疫異常，這3種機制在不同患者個體中單獨或聯合作用，最終導致造血功能衰竭[8]。近年來研究發現免疫異常在AA發病中起重要作用，是造成AA造血功能異常的主要原因，T淋巴細胞功能亢進，CD4+與CD8+細胞亞群數量與比值改變，導致免疫功能發生改變，其免疫作用以造血細胞為靶細胞，最終造成全血細胞減少[9]。AA患者長期依賴輸血，導致鐵沉積，造成機體鐵過載，研究發現鐵過載可通過升高活性氧（ROS）從而損傷骨髓造血功能，包括直接對造血干細胞[10]以及間接對造血支持間充質細胞[11]的數量和功能損傷。鐵過載和機體免疫力的關系近年越來越被重視，免疫因素的介入會加劇鐵過載的危害，機體的預后也與鐵過載程度相關[12]。本實驗以免疫因素作為切入點，分析AA患者和鐵過載的免疫聯系，初步探討鐵過載對AA患者淋巴細胞亞群的影響。

本研究血常規檢測結果發現鐵過載組外周血淋巴細胞絕對數降低，中性粒細胞絕對數變化不明顯，提示鐵過載對淋巴細胞影響較大，于是筆者進一步分析淋巴細胞亞群，結果顯示鐵過載組與非鐵過載組比較，T細胞和NK細胞比例顯著降低。研究發現鐵既是參與紅系造血的重要原料，又作為氧化還原反應的重要催化劑，鐵過載使ROS自由基的生產增加[13]，過度的ROS積累可能會導致蛋白和基因氧化損傷，進一步導致細胞的衰老和凋亡[14-15]。有研究顯示鐵過載通過升高ROS水平，對T淋巴細胞起重要的調節作用，從而影響機體免疫功能[16]。基于以上結果，筆者進一步分析T細胞和NK細胞與鐵蛋白的相關性，發現鐵過載組NK細胞與鐵蛋白呈負相關，提示鐵過載對AA患者NK細胞影響較大。NK細胞是一類大顆粒淋巴細胞，通過一系列生物學過程獲得激活信號，包括鈣內流、細胞骨架重排以及與靶細胞接觸部位免疫突觸形成等，最終通過分泌細胞因子、趨化因子及釋放毒性顆粒執行殺傷和免疫調節功能。Hua等[17]研究骨髓異常增生綜合征鐵過載與非鐵過載患者發現，鐵過載組NK細胞內ROS水平升高，主要通過p38和JNK信號通路對NK細胞凋亡進行調控。

綜上所述，鐵過載對AA患者T淋巴細胞和NK細胞有較大的影響，同時發現鐵過載程度與NK細胞具有負相關性，提示鐵過載對NK細胞的影響更大，但相關研究目前尚缺乏，筆者將進一步深入研究鐵過載對NK細胞的作用機制，為臨床治療AA患者鐵過載導致的免疫功能紊亂提供理論客觀依據。