TLR信號通路關鍵因子在肺腺癌組織中的表達與臨床意義

宋鵬濤 馬志紅 許麗敏 周凌燕 張建斌 平金良

肺癌是我國乃至世界范圍內常見的惡性腫瘤，因缺乏有效的診斷標志物造成其早期診斷率低及預后判斷難，一旦發現大部分已處于晚期，導致治療效果差、預后不良、病死率極高，嚴重威脅人類的健康[1]。隨著對炎癥與腫瘤生長相關關系研究的不斷深入，發現慢性感染和炎癥在促進腫瘤發生和演化過程中起著十分重要的作用，被認為是最重要的后天性和環境因素[2]。大量的研究結果均表明炎癥免疫系統的激活與癌癥的發生有關，以慢性炎癥為特點的腫瘤微環境，能促進腫瘤的發生和發展[3-4]。

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）在固有免疫應答中發揮著重要的作用，國內外大量的研究表明其與肺癌的發生存在一定的相關性。何鳳蓮等[5]及高勝利[6]研究表明 Toll樣受體 4（Toll-like receptors 4，TLR4）蛋白的表達與非小細胞肺癌的組織分化程度密切相關。筆者前期研究也表明TLR4和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）蛋白在肺腺癌組織中的表達水平明顯高于正常肺組織，因而進一步采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）法和RT-PCR法研究TLR4及其相關信號通路關鍵因子在肺腺癌組織中的表達及臨床意義，以期為肺腺癌的早期診斷和臨床預后評估提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年7月至2018年12月于本院手術治療的肺腺癌患者92例作為研究對象，其中男42例，女 50 例，年齡 30～78（58.0±22.5）歲。均經 2 位病理科醫生確診，手術前均未接受過放射治療和化學藥物治療等處理。腫瘤組織標本均按2009年國際抗癌聯盟（AJCC）TNM分期標準進行臨床分期，其中Ⅰ、Ⅱ期53例，Ⅲ、Ⅳ期39例；低分化45例，高、中分化47例。并選擇其中30例距腫瘤5cm遠的正常肺組織作為對照。

1.2 主要試劑 TLR4抗體（批號：3253-100）、髓樣分化因子 88（myeloid different iation factor88,MyD88）抗體（批號：3244R-100）、腫瘤壞死因子受體相關因子6（TNF receptor associated factor 6,TRAF6）抗體（批號：3566R-100）均購自美國 BioVision公司，NF-κB抗體（批號：ab16502）、白介素-1 受體相關激酶-1（Interleukin-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1）抗體（批號：ab238）、IRAK4 抗體（批號：ab119942）均購自英國abcam公司。Super ScriptTMⅢ逆轉錄酶（批號：11904018）購自美國Invitrogen公司。

1.3 TLR信號通路關鍵因子蛋白表達量檢測 將存檔的肺腺癌組織和正常肺組織標本進行切片，厚約4μm。采用免疫組化法檢測，操作步驟按檢測試劑盒說明書進行：常規方法脫蠟，梯度乙醇（95%、85%、75%）脫水，抗原修復液（0.01M的枸櫞酸鈉緩沖液，pH6.0）修復2次，PBS洗滌3次，一抗（1∶2 000兔抗人）4℃過夜（陰性對照所用的一抗為正常羊血清），磷酸緩沖鹽溶液洗滌，加入二抗，37℃孵育30min，二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片后進行觀察。TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1、IRAK4、TRAF6蛋白的免疫組化結果判斷標準參考Yu等[7]報道的方法，光學顯微鏡下觀察組織標本的著色范圍與著色強度。TLR4、MyD88、IRAK1、IRAK4、TRAF6蛋白的陽性表達主要表現為細胞質及細胞膜上呈現棕黃色或棕褐色顆粒，NF-κB蛋白的陽性表達主要表現為細胞質或細胞核中有棕褐色或棕黃色顆粒沉淀。隨機選取5個不同的視野，計算陽性細胞總數，按陽性細胞數所占百分比計算分值：≤10%為1分，＞10%且≤50%為2分，＞50%且≤75%為3分，＞75%為4分。同時按照染色的強弱程度計算分值：陰性為1分，弱染色為2分，中等染色為3分，強染色為4分。上述兩種分值的乘積作為最終結果：＜4 分為－；4～7 分為＋；8～12分為＋＋；13～16 分為＋＋＋。＋＋和＋＋＋為高表達，－和＋為低表達。

1.4 TLR信號通路關鍵因子mRNA表達水平檢測 采用TRIzol提取肺腺癌和正常肺組織的總RNA，進而利用Super ScriptTMⅢ逆轉錄酶轉錄合成cDNA。設計引物進行采用RT-PCR法檢測。所有樣品均分3管同時擴增，計算單個樣品的循環閾值（Cycle threshold,CT）值并取平均值，TLR信號通路關鍵因子mRNA的表達水平采用 2-ΔΔCt方法計算。

1.5 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料用±s表示，計數資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌組織和正常肺組織TLR信號通路關鍵因子蛋白表達的比較TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1、IRAK4蛋白在肺腺癌組織中的高表達率分別為76.09%（70/92）、70.65%（65/92）、67.39%（62/92）、68.47%（63/92）、64.13%（59/92），在正常肺組織中的高表達率分別為 16.67%（5/30）、13.33%（4/30）、10.00%（3/30）、13.33%（4/30）、6.67%（2/30），兩者比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。TRAF6蛋白在肺腺癌組織中的高表達率為 20.65%（19/92），與正常肺組織的 20.00%（6/30）比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1（插頁）。

2.2 不同臨床病理特征肺腺癌患者肺腺癌組織中TLR信號通路關鍵因子蛋白表達強度的比較 不同性別、年齡、腫瘤大小、分化程度患者TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1、IRAK4蛋白比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），而不同程度淋巴結轉移、臨床分期、遠處轉移患者上述蛋白比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。不同性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移、臨床分期、遠處轉移患者TRAF6蛋白比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.3 肺腺癌組織和正常肺組織TLR信號通路關鍵因子mRNA表達水平比較 肺腺癌組織中TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1和IRAK4 mRNA表達水平均明顯高于正常肺組織，差異均有統計學意義（均P＜0.05），而TRAF6 mRNA的表達水平與正常肺組織比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表 2。

3 討論

腫瘤的發生和發展是一個多階段、多系統共作用的復雜過程，其主要包括細胞致瘤性轉化、抗凋亡、促生長、免疫逃脫及侵襲與轉移等這幾個過程[3]。近年來的臨床和流行病學研究均表明在腫瘤的發生和發展過程中慢性感染和炎癥起著十分重要的作用，尤其炎癥是腫瘤產生過程的一個關鍵因子。

TLR是介導免疫反應過程中的一個重要信號通路，其主要通過識別病原相關分子模式激活機體免疫反應，大量的研究表明TLR介導的信號通路與癌癥的發生、發展有著密切的相關性，如胃癌、腸癌、乳腺癌的發生均與TLR表達上調密切相關[2-4]。TLR4是與腫瘤的發生和發展最為密切的TLR家族成員之一，在對肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、胃癌等癌細胞的發生、發展及其生長轉移研究過程中也發現TLR4多表達于上述腫瘤細胞，且其與生長轉移存在一定的關聯性[8-9]。Chen等[10]利用細菌組成成分及內源性配基進行刺激發現TLR激活NF-κB從而刺激了內部促炎因子的產生，進而促進腫瘤生長及化療藥物抗藥性的產生。Kelly等[11]利用LPS刺激人卵巢癌細胞，發現其可激活NF-κB信號通路，激活下游促炎因子的產生，進而促進腫瘤細胞的增殖，同時，該研究還發現 TLR4主要表達于人卵巢癌細胞表面。本研究結果表明，肺腺癌組織中TLR4、NF-κB蛋白的陽性高表達率分別為76.09%（70/92）和70.65%（65/92），顯著高于正常肺組織，TLR4、NF-κB 在肺腺癌組織中的表達上調可能參與病程的發生、發展。此外，相關性分析結果顯示，肺腺癌組織中TLR4、NF-κB蛋白的高表達與肺腺癌患者的分期、遠處轉移有較強的相關性，提示上調表達的TLR4、NF-κB可能與患者的預后相關，這與Inoue等和Pikarsky等[12-13]的研究結果一致。

表1 不同臨床病理特征肺腺癌患者肺腺癌組織中TLR信號通路關鍵因子蛋白表達強度的比較

續表

眾所周知，MyD88是TLR信號轉導通路中最重要的銜接蛋白。它首先與IRAK4結合，進而促進IRAK4介導的IRAK1磷酸化，之后被高磷酸化的IRAK1進入胞質募集可溶性TRAF6，進而激活其相關的2種信號通路[14]。為進一步確定TLR信號通路關鍵因子在肺腺癌組織中的表達情況及相關性，筆者對其下游信號通路關鍵因子進行檢測，發現MyD88、IRAK1、IRAK4在肺腺癌組織均呈高表達。查道德等[15]對LPS刺激的肺癌細胞株（A549）和非小細胞肺癌細胞株（H1299）研究發現，可通過誘導TLR4信號通路，刺激免疫抑制因子的產生，進而促進肺癌細胞的免疫逃逸。本研究結果也提示肺腺癌組織中TLR4和NF-κB的表達水平顯著高于正常肺組織，同時，其下游通路關鍵因子MyD88、IRAK1、IRAK4的表達水平也相應的隨著前兩者的升高而升高，表明MyD88、IRAK1、IRAK4的表達受其調控，這也從另一角度表明其可通過TLR4/NF-κB信號通路誘導相關細胞因子的產生，進而使肺腺癌細胞逃避免疫監視，促進腫瘤細胞增長。同時，本研究結果也提示TRAF6的表達水平與之并無顯著的相關性，但最近的多項研究表明，TRAF6在多種腫瘤的形成和發展中發揮重要作用[16]，同時，Sun等[17]和Han等[18]敲除TRAF6基因后發現食管癌細胞的增殖明顯的受到了抑制作用，這表明TRAF6參與了食管癌的發生、發展和侵襲作用，但本研究結果表明TRAF6的表達與肺腺癌的發生無顯著相關性，其具體原因有待進一步研究。

綜上所述，本研究從不同角度驗證了TLR信號通路關鍵因子 TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1、IRAK4 在肺腺癌中高表達與其淋巴結轉移、臨床分期、遠處轉移相關，表達上調的信號通路關鍵因子參與了肺腺癌的發生、發展及預后等進程，但其具體機制仍需進一步深入研究。