MMP-3抑制劑Ⅰ結(jié)合中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)治療膝骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的效果

余艷梅 黃振 譚同才 程瑞動(dòng) 邵玉玲 劉勇

膝骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是臨床上以膝關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙為主要表現(xiàn)的常見(jiàn)骨關(guān)節(jié)病。在中國(guó)患病數(shù)已超過(guò)5 000萬(wàn)，致殘率超過(guò)50%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）抑制劑能通過(guò)抑制MMP-3的表達(dá)水平來(lái)降低細(xì)胞外基質(zhì)的降解水平，從而修復(fù)受損的關(guān)節(jié)軟骨。但研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)其修復(fù)的軟骨細(xì)胞形態(tài)不均勻、膠原排列紊亂，軟骨基質(zhì)內(nèi)少量潮線形成，軟骨外觀形態(tài)雖然較好，但關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)水平較低，無(wú)法滿(mǎn)足膝關(guān)節(jié)的長(zhǎng)期負(fù)重要求[1]。本研究觀察MMP-3抑制劑Ⅰ結(jié)合中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)KOA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)效果，報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選擇3月齡雄性SD大鼠48只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供。大鼠按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物飼養(yǎng)，動(dòng)物房室溫18～22℃，相對(duì)濕度40%～60%，每天的明暗時(shí)間各為12h，自由攝食、飲水，實(shí)驗(yàn)之前均未行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)及其他刺激。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成正常組、模型組、抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺(tái)組4組，每組12只。

1.2 主要試劑 碘乙酸鈉（批號(hào)：SLBG2033V）購(gòu)自美國(guó)sigma公司；MMP-3抑制劑Ⅰ：金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑N-異丁基-N-（4-甲氧苯磺酰）-甘氨酰異羥肟酸（NNGH）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；水合氯醛（批號(hào)：H37022673）購(gòu)自青島宇龍海藻有限公司；甲醛（批號(hào)：DF0135）購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；乙二胺四乙酸EDTA（批號(hào)：20171111）購(gòu)自天津市化學(xué)試劑廠；ELISA試劑盒（批號(hào)：ab53015）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，DAB顯色試劑盒（批號(hào)：K152317J）購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 模型組、抑制劑組、抑制劑結(jié)合跑臺(tái)組大鼠采用關(guān)節(jié)腔注射的方式建立KOA模型大鼠[2]：腹腔注射10%水合氯醛0.3ml/kg，麻醉成功后在無(wú)菌條件下由髕腱外側(cè)向大鼠右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4%碘乙酸鈉溶液50μ（l碘乙酸鈉1mg，稀釋于50μl 0.9%氯化鈉溶液中）。注射過(guò)程中3組大鼠均無(wú)不良反應(yīng)發(fā)生。建模成功后，抑制劑組大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MMP-3抑制劑Ⅰ60μ（l高濃度2mmol/L），1次/周，共注射4周，注射后籠內(nèi)安靜飼養(yǎng)、自由活動(dòng)。抑制劑結(jié)合跑臺(tái)組大鼠建模前先進(jìn)行3d跑臺(tái)適應(yīng)訓(xùn)練，膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射MMP-3抑制劑Ⅰ（劑量、方法同上），4周后進(jìn)行中等強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練，持續(xù)6周。適應(yīng)訓(xùn)練：采用段氏PT2000型鼠類(lèi)跑臺(tái)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)，坡度 0°，速度 10m/min，時(shí)間 10min，連續(xù) 3d。中等強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練：上午8：00-12：00進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，參考Bedford等[3]的方法，坡度設(shè)定為5°，速度設(shè)定為18m/min，每次20min，運(yùn)動(dòng)1次/d，每周運(yùn)動(dòng)5d，共6周。運(yùn)動(dòng)中可選用聲音、小木棒強(qiáng)迫驅(qū)動(dòng)等方式刺激大鼠持續(xù)運(yùn)動(dòng)，但運(yùn)動(dòng)過(guò)程中不用電刺激。正常組大鼠不作任何處理。

1.4 主要觀察指標(biāo)

1.4.1 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)觀察 4組大鼠同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，10周完成上述試驗(yàn)后，用頸椎脫位法處死各組大鼠取材，在抽取大鼠心臟血液后切開(kāi)右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)皮膚和皮下組織，鈍性分離周邊肌肉，暴露右膝關(guān)節(jié)并切開(kāi)，切取股骨遠(yuǎn)端軟骨組織，置于10%甲醛溶液中固定24h，隨后浸于15%乙二胺四乙酸溶液中脫鈣，4周后包埋切片，蕃紅O-固綠染色，光鏡下觀察，采用O’Driscoll組織學(xué)評(píng)分法[4]分析關(guān)節(jié)軟骨組織及軟骨細(xì)胞。

1.4.2 大鼠血清MMP-3表達(dá)水平測(cè)定 采用ELISA法。實(shí)驗(yàn)前大鼠麻醉后，取尾靜脈血1.2ml，常溫下凝固，隨后在低溫環(huán)境中離心，2 000r/min，15min，獲得血清400μl，-80℃存儲(chǔ)。實(shí)驗(yàn)完成后處死大鼠剖胸，心臟抽取血液1.2ml，按上述離心法獲取血清。血清檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定檢測(cè)標(biāo)本吸光度值（A值）。將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量含量作為水平坐標(biāo)，將A值作為縱坐標(biāo)，按照樣品A值在對(duì)應(yīng)曲線中的狀態(tài)，計(jì)算實(shí)驗(yàn)前后MMP-3的表達(dá)水平，并計(jì)算相應(yīng)的差值，差值越大，提示關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)狀態(tài)越不理想。

1.4.3 關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)水平檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法。軟骨切片脫蠟，梯度乙醇脫水，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加一抗，于4℃濕盒中孵育過(guò)夜。PBS沖洗后，加二抗，室溫下孵育30 min，加DAB顯色，自來(lái)水沖洗終止顯色，復(fù)染、脫水、透明、封片，鏡下觀察并拍照記錄。采用Image-Proplus 6.0軟件，測(cè)定單位面積軟骨組織切片Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色平均A值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠軟骨O’Driscoll組織學(xué)評(píng)分比較 實(shí)驗(yàn)前模型組、抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺(tái)組3組大鼠軟骨O’Driscoll組織學(xué)評(píng)分組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），3組評(píng)分均低于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)后抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺(tái)組大鼠軟骨O’Driscoll組織學(xué)評(píng)分均高于模型組、低于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)后抑制劑結(jié)合跑臺(tái)組大鼠軟骨O’Driscoll組織學(xué)評(píng)分高于抑制劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)前后四組大鼠軟骨O’Driscoll組織學(xué)評(píng)分結(jié)果（分）

2.2 各組大鼠血清MMP-3表達(dá)水平比較 實(shí)驗(yàn)前模型組、抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺(tái)組3組大鼠血清MMP-3表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），3組大鼠血清MMP-3表達(dá)水平均高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)后抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺(tái)組大鼠血清MMP-3表達(dá)水平均低于模型組、高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)后抑制劑結(jié)合跑臺(tái)組大鼠血清MMP-3表達(dá)水平低于抑制劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)前后各組大鼠血清MMP-3表達(dá)水平比較（μg/L）

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)水平比較 實(shí)驗(yàn)前模型組、抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺(tái)組3組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），3組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)水平均低于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)后抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺(tái)組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)水平均高于模型組、低于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)后抑制劑結(jié)合跑臺(tái)組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)水平高于抑制劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

膝關(guān)節(jié)是主要的負(fù)重關(guān)節(jié)，在行走時(shí)其關(guān)節(jié)面承受的最大軸向作用力為體重的2.3～7.1倍[5]，前后方向的受力為體重的0.35～2.3倍[6-7]。較大的軸向作用力決定了膝關(guān)節(jié)需要結(jié)構(gòu)和功能俱佳的關(guān)節(jié)軟骨。

表3 實(shí)驗(yàn)前后各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)水平比較

KOA病程中，主要病理特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨的不斷丟失[8]。關(guān)節(jié)軟骨由軟骨基質(zhì)和軟骨細(xì)胞組成。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的代謝平衡能維持軟骨的正常功能。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，關(guān)節(jié)內(nèi)部最重要的膠原是Ⅱ型膠原，其占據(jù)的比例超過(guò)了整體膠原的90%。造成關(guān)節(jié)失去生物力學(xué)特征的主要因素是Ⅱ型膠原和蛋白多糖的改變[9]，這種改變與KOA的病程存在密切的聯(lián)系。

研究表明，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨被破壞的關(guān)鍵因素是細(xì)胞外基質(zhì)的形成與降解失序[10]。基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs）是 MMP活性的特異性抑制劑。MMP-3是MMP的關(guān)鍵組成，對(duì)多糖具備充分的裂解活性[11]，在基質(zhì)降解過(guò)程中和軟骨破壞（特別是骨關(guān)節(jié)炎）的病理發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12-13]，所以MMP-3是造成關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵致病因素[14-16]。抑制劑Ⅰ和MMP-3分子共同形成的特殊復(fù)合物是MMP-3的抑制劑，可以高效抑制MMP-3的活性。正常情況下，兩者之間會(huì)維持平衡狀態(tài)，但在產(chǎn)生KOA的情況下，相應(yīng)細(xì)胞表達(dá)的MMP-3水平高于抑制劑Ⅰ，抑制劑活性降低，MMP-3活性有一定程度的提升[17]，造成了軟骨以及滑膜等產(chǎn)生退變甚至被破壞。本研究中，抑制劑組和抑制劑結(jié)合跑臺(tái)組的大鼠注射了MMP-3抑制劑Ⅰ后血清MMP-3的表達(dá)水平降低，關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)水平提高，說(shuō)明人為注射MMP-3抑制劑能夠降低MMP-3的表達(dá)水平來(lái)降低細(xì)胞外基質(zhì)的降解水平，從而修復(fù)受損的關(guān)節(jié)軟骨。但研究發(fā)現(xiàn)修復(fù)的軟骨中軟骨細(xì)胞形態(tài)不均勻、膠原排列紊亂，軟骨基質(zhì)內(nèi)少量潮線形成，軟骨外觀形態(tài)上雖較好，但關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)水平較低，失去了正常軟骨組織的特性及功能[13，18]，無(wú)法滿(mǎn)足膝關(guān)節(jié)長(zhǎng)期的負(fù)重要求。有研究表明，適度活動(dòng)可保持關(guān)節(jié)健康，過(guò)度活動(dòng)會(huì)造成軟骨產(chǎn)生退變[19]；高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)[2，20]及長(zhǎng)時(shí)間制動(dòng)[21]均對(duì)關(guān)節(jié)不利。本研究結(jié)果顯示抑制劑組及抑制劑結(jié)合跑臺(tái)組的MMP-3表達(dá)水平相較于模型組都有所降低；抑制劑結(jié)合跑臺(tái)組的MMP-3表達(dá)水平相較于抑制劑組有明顯的降低，關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)水平相較于抑制劑組有明顯提高，說(shuō)明關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原的表達(dá)有促進(jìn)作用，可能機(jī)制如下：運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的關(guān)節(jié)滑液是關(guān)節(jié)軟骨營(yíng)養(yǎng)的重要來(lái)源；運(yùn)動(dòng)可以減少關(guān)節(jié)粘連，增加關(guān)節(jié)周?chē)€(wěn)定性，減少關(guān)節(jié)軟骨負(fù)荷，減少關(guān)節(jié)內(nèi)壓力，加快關(guān)節(jié)滑液的擴(kuò)散，這讓軟骨修復(fù)具備一個(gè)更好的環(huán)境。但具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

另有學(xué)者對(duì)于在大量運(yùn)動(dòng)之后是否可以通過(guò)注射MMP-3抑制劑抑制MMP-3的高表達(dá)來(lái)預(yù)防軟骨損傷的問(wèn)題作了進(jìn)一步研究，此項(xiàng)研究也表明損傷后可依靠注射MMP-3抑制劑來(lái)加速機(jī)體的修復(fù)，但是這一研究未能探討以此為治療方案的可行性問(wèn)題[22]。其余有關(guān)MMP-3抑制劑的分析也很少探討該問(wèn)題。本研究為臨床KOA患者的治療和康復(fù)，尤其是遠(yuǎn)期療效方面，提供了一個(gè)臨床思路和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。