金水清合劑對IgA腎病大鼠TGF-β1、CTGF、VEGF表達的影響

李卉 王林群 張雪榮

摘要 目的：探討復方中藥金水清合劑對IgA腎病大鼠TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白及mRNA表達的影響。方法：4周齡SPF級SD大鼠40只，隨機分為正常組、模型組、治療1組、治療2組、治療3組，復制大鼠IgA腎病模型，觀察組在模型組的基礎上，分別于第5周、第7周、第9周，給予金水清合劑灌胃治療，1次/d，至第12周末，HE及PAS染色觀察腎臟病理學改變，Western-blot檢測腎組織TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白的表達，RT-PCR檢測TGF-β1、VEGF及CTGF mRNA的表達。結果：正常組大鼠腎組織結構完整清晰，模型組大鼠可見腎小球系膜區增寬，系膜基質、系膜細胞中到重度增生，觀察組病變程度比模型組輕，治療1組改善最為明顯。與正常組比較，模型組TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白的表達升高，且差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，觀察組表達降低，且差異有統計學意義（P<0.05）;觀察組間比較差異有統計學意義（P<0.05）;與正常組比較，模型組TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA的表達升高，且差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，觀察組表達降低，且差異有統計學意義（P<0.05）;觀察組間比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：金水清合劑能顯著改善IgA腎病大鼠腎臟損害，早期治療改善最為明顯，其作用機制可能為下調TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白及mRNA的表達。

關鍵詞 金水清合劑;IgA腎病;大鼠模型;TGF-β1;CTGF;VEGF

Abstract Objective：To investigate the effects of Jinshuiqing Mixture on the expression of TGF-β1，CTGF，VEGF protein and mRNA in IgA nephropathy rats.Methods：A total of 40 4-week-old SPF SD rats were randomly divided into a normal groups，a model group，treatment group 1，treatment group 2 and treatment group 3.Rat IgA nephropathy model was copied.Based on the model group，the treatment group was given Jinshuiqing Mixture by gavage once per day in the 5th week，the 7th week and the 9th week respectively till the end of 12th week.Pathological changes in kidney were observed by HE staining and PAS staining.The protein expression of TGF-β1，CTGF and VEGF was detected by Western blot，and the expression of TGF-β1，VEGF and CTGF and mRNA was detected by RT-PCR.Results：In the normal group，the renal tissue structure was complete and clear.In the model group，mesangial area was widened，and mesangial cells and mesangial matrix were moderately to severely proliferated.The degree of lesions in the treatment group was lighter than that in the model group.And the improvement of treatment group 1 was the most obvious one.Compared with the normal group，the expression of TGF-β1，CTGF and VEGF protein in the model group increased significantly and the difference was statistically significant （P<0.05）; compared with the model group，the expression in the treatment group decreased greatly and the difference was statistically significant （P<0.05）; compared among the treatment groups，and the difference was statistically significant （P<0.05）; compared with the normal group，the expression of TGF-β1，CTGF，VEGF mRNA in the model group was significantly higher，and there was significant difference （P<0.05）; compared with the model group，the expression in the treatment group was lower，and the difference was statistically significant （P<0.05）; compared among the treatment groups，and the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion：Jinshuiqing Mixture can significantly improve the renal damage of IgA nephropathy rats，and early treatment improvement is most obvious.Its mechanism may be down regulating the expression of TGF-β1，CTGF，VEGF protein and mRNA.

Keywords Jinshuiqing Mixture; IgA nephropathy; Rat model; TGF-β1; CTGF; VEGF

IgA腎病是一種常見的原發性腎小球疾病，是引起兒童血尿的主要疾病之一[1]，部分可以伴有不同程度蛋白尿，一項國內大樣本多中心的調查資料顯示45.25%患者病理改變為Ⅲ-Ⅴ級，病情多數呈慢性進行性發展，并逐漸出現腎臟功能受損[2]。對于IgA腎病鏡下血尿是否需要治療，存在爭議，主要是早期治療能否阻止或延緩腎臟功能受損。現代研究認為腎小球硬化、腎間質纖維化和細胞外基質增生是IgA腎病進展到終末期腎病的重要通路[3]。湖北省中醫院國家名老中醫倪珠英教授創立并研制了治療血尿的金水清合劑（金水清），主要是針對血尿濕熱證表現患者，對血尿癥狀改善臨床療效顯著[4]，本研究擬觀察金水清在疾病不同時期干預對大鼠腎臟組織TGF-β1、CTGF、VEGF表達的影響，探討金水清治療IgA腎病的作用機制及早期干預是否能延緩IgA腎病腎臟病理進展，并最終改善預后。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

4周齡健康SPF級別SD雄性大鼠40只，體質量（100±10）g，由湖北省實驗動物中心提供，許可證號SCXK（鄂）2015-0018，飼養于湖北中醫藥大學SPF級動物實驗室，屏障環境，溫度（24±1）℃，相對濕度（55±10）%，12 h光照晝夜循環，造模期按要求置于人工氣候箱調節溫度濕度。

1.1.2 藥物

金水清合劑（湖北省中醫院制劑室生產，批號：鄂藥制字Z20113149），制作方式：由漏蘆、連翹、甘草等份用水蒸汽蒸餾，提取芳香水，再煎煮濃縮至1 g/mL，與提取芳香水混勻，無菌條件下灌裝。

1.1.3 試劑與儀器

牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司，貨號：G5001-100）;脂多糖（LPS，Solarbio公司，貨號：L8880）;四氯化碳（CCl4）（湖北醫藥集團宏科化工儀器有限公司，貨號：00023）;IgA試劑（NOVUS公司，貨號：NB7110）;BCA蛋白濃度試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：G2026）;RIPA裂解液（Servicebio公司，貨號：G2002）、磷酸化蛋白酶抑制劑（Servicebio公司，貨號：G2007）、顯影定影試劑（Servicebio公司，貨號：G2007）、β-actin（Servicebio公司，貨號：G2007）、HRP標記山羊抗兔（Servicebio公司，貨號：GB23303）、HRP標記驢抗山羊（Servicebio公司，貨號：GB23404）、HRP標記山羊抗小鼠（Servicebio公司，貨號：GB23301）、HRP標記山羊抗大鼠（Servicebio公司，貨號：GB23302）、TBS緩沖液（Servicebio公司，貨號：GB0001）、脫脂奶粉（Servicebio公司，貨號：G5002），RNA提取液（Servicebio公司，貨號：G3013）。

冷凍離心機（Heal force，型號：neofuge 13R），純水儀（重慶艾科浦，型號：AJC-0501-P），電泳儀（北京六一儀器廠，型號：DYY-6C），灰度分析軟件（Alpha Innotech，型號：AlphaEaseFC），勻漿儀（康濤科技有限公司，型號：KZ-II），超微量分光光度計（Thermo公司，型號：THM#10300101），人工氣候箱（金壇市訊生儀器廠，型號：RZ-280B）。

高糖高脂飼料，由湖北省實驗動物中心提供，配方為：50 kg飼料含豬油5 kg，蛋黃粉2.5 kg，膽固醇0.5 kg，膽酸鈉0.1 kg，糖7.5 kg，基礎飼料34.4 kg。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

40只大鼠在SPF級實驗室經普通飼料適應性飼養1周后，試紙檢測尿紅細胞、尿蛋白全部為陰性，隨機分為5組，每組8只，分別為正常組、模型組、治療1組、治療2組、治療3組。

正常組：正常飼料喂養。隔日灌服酸化水2 mL，第6、8周尾靜脈注射生理鹽水0.5 mL。

模型組：持續高糖高脂飲食，隔日灌胃含0.1%BSA的酸化水（400 mg/kg）2 mL，1次/周皮下注射CCl4 0.1 mL+花生油0.3 mL，共12周。在第4周時，增加環境因素，將大鼠置于恒溫恒濕箱中共120 h（溫度由28～35 ℃，濕度由70%～95%），溫度和濕度逐步提升，每天不超過5 ℃，溫度濕度峰值不超過24 h，120 h后移至自然環境。第6周尾靜脈注射1%BSA酸化水20 mg/（kg·次），1次/d，連續3次，第6周、8周尾靜脈注射LPS（0.05 mg/只）1次，觀察至第12周末。尿液經尿沉渣分析儀檢測出現血尿或蛋白尿，腎臟病理改變符合系膜增殖性腎炎表現，免疫熒光有IgA沉積，提示造模成功。

觀察組：在模型組的基礎上，給予金水清合劑灌胃。

1.2.2 給藥方法

觀察組在模型組的基礎上，給予金水清合劑灌胃，給藥劑量均為6.3 g/（kg·d）。根據灌胃起始時間不同分為治療1組、治療2組、治療3組，起始時間分別為第5周、第7周、第9周，1次/d，至第12周末。

1.2.3 檢測指標與方法

光鏡：第12周治療結束，頸椎脫臼法處死大鼠。切取右側腎臟，HE及PAS染色觀察腎臟病理學改變。

Western-blot檢測腎組織TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白的表達：冷PBS液體、洗滌腎組織塊，共2～3次，剪刀剪成小塊置于勻漿管中。加入直徑2 mm的小磁珠，1～2個，加入試劑（為組織體積的10倍）徹底勻漿。在4 ℃條件下離心，12 000 r/min，10 min，離心半徑22 cm，離心后的中間清亮液體即為組織總蛋白質。將蛋白溶液按照4∶1加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性15 min，-20 ℃冰箱保存備用。按照實驗的需要配制相應濃度的分離膠，加入TEMED后立即搖勻后灌膠。分離膠凝固后倒去膠上層水并用吸水紙吸干。SDS-PAGE電泳，濃縮膠電壓75 V，分離膠電壓120 V。溴酚藍剛跑出時終止電泳，然后轉膜、顯色。掃描膠片并存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件分析目標帶的光密度值。

RT-PCR檢測TGF-β1、VEGF及CTGF mRNA的表達：腎組織放于-80 ℃貯存待用。RT-PCR檢測TGF-β1、VEGF及CTGF mRNA表達水平。按Trizol（美國Invitrogen）說明書提取各組腎皮質總RNA，并反轉，錄成cDNA。引物序列采用Primer5.0統計軟件設計。以β-actin為內參基因，引物均由Servicebio公司合成。見表1。應用CT法：

A=CT目的基因-CTβ-actin，B=CT目的基因-CT內標基因，K=A-B，表達倍數=2-K。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，其中計數資料以（%）表示，采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎組織病理形態學觀察

正常組大鼠腎組織結構完整清晰，腎小球體積形態正常，腎小囊內無明顯滲出，系膜細胞及系膜區無增生，腎小管結構完整，管腔內未見明顯管型，無炎性細胞浸潤。模型組大鼠可見腎小球腫脹，腎小球內細胞增多，系膜區增寬，中到重度系膜細胞、系膜基質增生，毛細血管管腔狹窄，袢開放不良，部分腎小管上皮細胞腫脹變性，腎小管間質有少許炎性細胞浸潤。各觀察組病理改變程度均比模型組輕，治療1組改善最為明顯。見圖1。

2.2 各組腎組織TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白表達的比較

與正常組比較，模型組TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白表達升高，且差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，觀察組1組、觀察組2組、觀察組3組TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白表達降低，且差異有統計學意義（P<0.05）;治療1組與治療2組比較，差異有統計學意義（P<0.05）;治療2組與治療3組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2，圖2。

2.3 各組大鼠腎組織TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表達的比較

與正常組比較，模型組TGF-β1、CTGF、VEGFmRNA的表達升高，且差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，觀察組1組、觀察組2組、觀察組3組TGF-β1、CTGF、VEGFmRNA的表達降低，且差異有統計學意義（P<0.05）;治療1組與治療2組比較，差異有統計學意義（P<0.05）;治療2組與治療3組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

我院國家級名老中醫倪珠英教授在兒童血尿診治方面臨床療效顯著[5]，提倡早期治療，認為兒童血尿的主要病機是“以熱為先，因濕為重”[6-7]，主張濕熱既是導致IgA腎病發生的重要因素，又是影響其轉歸的病理關鍵，治療當以清熱利濕為法，據此研制了湖北省中醫院院內制劑“金水清合劑”，已投入臨床20余年。有臨床研究顯示[8]，IgA腎病患者中，濕熱體質的占46.7%，在IgA腎病中醫證型病理研究中發現，以濕熱證為主，且濕熱證患者的病理損傷程度和疾病嚴重程度均高于非濕熱證患者[9]，認為濕熱證可能提示患者細胞免疫處于活躍狀態，大量釋放細胞因子、炎性反應遞質，導致免疫復合物沉積增多，病理損傷加重[10]。金水清治療IgA腎病是通過改善患者的濕熱癥狀來緩解血尿情況，最終影響IgA腎病結局，我們對其具體干預機制做了進一步研究。

IgA腎病的預后與腎小球硬化和腎間質纖維化程度密切相關[3]，逆轉致纖維化的一些可溶性因子釋放，被認為是抗纖維化治療的重點，其中炎性反應因子起著至關重要的作用。轉化生長因子β（Transforming Growth Factor，TGF-β）是介導腎小球疾病進展的重要因子，其正常表達時通過抑制細胞增殖來維持正常的細胞數量從而抑制炎性反應，當其過度表達，可以刺激成纖維細胞合成細胞外基質（ECM），抑制ECM的降解，還能誘導腎間質成纖維細胞的聚集，激活腎小管上皮細胞啟動自噬機制，導致腎小管變性[11]，是促進腎纖維化的最重要的細胞因子之一[12]。有研究表明，在腎小球硬化腎炎各組中腎小球內TGF-β1蛋白表達均明顯高于正常對照組，認為TGF-β1參與了病變腎小球中的細胞外基質過量蓄積，在腎小球硬化過程中起重要作用[13]。

結締組織生長因子（Connective Tissue Growth Factor，CTGF）為TGF-β1促纖維化信號通路中的下游遞質分子，主要通過TGF-β1/Smads途徑，在腎纖維化發生發展中起重要作用。CTGF表達于腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞[14]，TGF-β1是其最強的誘導劑[15]。TGF-β1可刺激多種細胞分泌CTGF，主要在轉錄水平調節CTGF的表達，CTGF水平又可反向作用于相關細胞，調節TGF-β1對這些細胞的合成和促增生作用。雖然TGF-β1是導致組織纖維化形成的重要細胞因子之一，但它作用的靶細胞較多，效應多樣，除能促細胞增生和誘導組織纖維化外，還有抗細胞分化和抗炎等功能，因此完全阻斷其表達或活性，可能會影響相應細胞正常功能[16];與此相反，CTGF在生理狀態下表達水平較低，生物學效應相對單一，它可能僅介導TGF-β1的部分生物學效應，主要是刺激細胞增生和細胞外基質合成，會促進組織器官纖維化。因此，近年來將其作為一個比TGF-β1更特異、更有效地預防纖維化的治療新靶點[17]。

血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是血管內皮細胞特異性性促有絲分裂原，能刺激內皮細胞增殖和分化，增加血管通透性，加速新生血管生成[18]，在組織缺氧狀態下，可大量生成，改善組織缺血，另一方面，當腎臟組織受損，如系膜增生、內皮細胞受損或是基底膜破壞，導致腎小球局部缺氧，可以使腎小球內皮細胞VEGF高表達[19]，進而促進不成熟血管形成，導致血流動力學紊亂，加重腎臟損害[20-21]。有研究表明，該因子過高表達還可以引起腎小管萎縮、纖維化，參與蛋白尿的發生，其水平與尿蛋白呈正相關，并發現IgA腎病進展患者血液及腎臟組織的VEGF表達顯著增強，提示其對腎臟病的預后有一定預測作用[22]。

細胞因子對腎臟細胞并非孤立地發揮直線作用，是通過網絡實現與細胞的相互作用，在多因素多方向共同影響著腎臟疾病的發生和轉歸。我們早期的研究表明金水清可以緩解模型大鼠的濕熱癥狀，減輕血尿、蛋白尿水平及病理損傷[23]，并從多個角度分析了金水清治療IgA腎病機制，實驗證實[7，24-26]：金水清能抑制系膜細胞的增殖及代謝活性，誘導系膜細胞的凋亡;下調炎性反應因子NF-κB水平，減輕腎臟炎性反應[27]。本研究綜合前期基礎，通過監測促腎臟纖維化炎性反應因子表達水平的變化，觀察中藥金水清早期干預，對于減輕血尿及腎臟損害，從而抑制腎纖維化作用機制。結果顯示，各觀察組病理改變程度均比模型組輕，治療1組改善最為明顯;與模型組比較，觀察組1組、觀察組2組、觀察組3組TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白和mRNA表達降低，差異有統計學意義（P<0.05）;治療1組與治療2組比較，差異有統計學意義（P<0.05）;治療2組與治療3組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。說明金水清合劑能顯著改善IgA腎病大鼠腎臟損害，早期治療改善更為明顯，其延緩IgA腎病病理損傷的作用機制可能與下調腎臟組織TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白及mRNA的表達有關。

參考文獻

[1]楊宇真，楊青，莊捷秋，等.兒童孤立性血尿207例病理分析[J].中國中西醫結合腎病雜志，2007，8（5）291-292.

[2]蔣小云，陳述枚，楊霽云，等.33所醫院兒童原發性IgA腎病臨床和病理表現調查分析[J].中華兒科雜志，2007，45（4）：272-278.

[3]劉秋玉，劉偉偉，高建東.腎纖維化診斷生物標志物研究進展[J].醫學綜述，2019，25（15）：2967-2972.

[4]潘三.金水清合劑治療小兒孤立性血尿的回顧性研究[D].武漢：湖北中醫藥大學，2015.

[5]劉曉鷹，王林群.小兒血尿病證演變規律的回顧性驗證研究[J].遼寧中醫雜志，2013，40（5）：906-908.

[6]張雪榮，李云海.劉曉鷹教授治療小兒單純性血尿經驗[J].中醫藥通報，2005，4（2）：53-55.

[7]劉曉鷹，張雪榮，倪珠英.金水清對大鼠腎小球系膜細胞增殖及凋亡的影響[J].中國中西醫結合腎病雜志，2005，6（12）：691-694.

[8]劉永芳，陳幫明，王金象，等.240例IgA腎病中醫體質類型與實證的分布特征研究[J].中國中西醫結合腎病雜志，2017，18（3）：238-239.

[9]胡萬里.中醫宏觀辨證中IgA腎病濕熱證病理研究[J].新中醫，2013，45（8）：65-66.

[10]萬毅剛，孟憲杰，沈山梅，等.糖尿病腎病Ⅲ期患者尿蛋白譜特征及其與中醫證候的回歸分析[J].中國中藥雜志，2013，38（23）：4157-4163.

[11]XuY，YangS，HuangJ，etal.Tgf-β1 induces autophagy and promotes apoptosis in renal tubular epithelial cells[J].Int J Mol Med，2012，29（5）：781-790.

[12]Letlerio J，Bottinger EP.TGF-beta knockout and dominant-nagative：receptor transgenic mice[J].Miner Electrolyte Metab，1998，24：161.

[13]史偉，何朝生，劉雙信，等.轉化生長因子TGF-β1及Smad信號轉導通路在腎小球硬化中的作用[J].中華腎臟病雜志，2005，21（5）：270-273.

[14]Ruiz-Ortega M，Rupérez M，Esteban V，et al.Angiotensin Ⅱ：a key factor in the inflammatory and fibrotic response in kidney diseases[J].Nephrol Dial Transplant，2006，21（1）：16-20.

[15]Gmtendorst GR，Okochi H，Hayashi N.A novel transforming growth factor beta response element controls the expression of the connective tissue growth factor gene[J].Ceu Growth Differ，1996，7：469-480.

[16]Basile DP The transforming growth factor beta system in kidney disease and repair[J].Recent progress and future directions，1999，8：21.

[17]趙青，陳楠.結締組織生長因子與腎纖維化的關系[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2001，10（4）：366-368.

[18]厲洪江，張迎輝，劉翠華，等.血漿血管內皮生長因子、尿微量白蛋白及β2-微球蛋白與過敏性紫癜患兒早期腎損傷的相關性[J].新鄉醫學院學報，2008，25（2）：173-175.

[19]李博，蘭小梅，張艷，等.血管內皮生長因子與IgA腎病預后不良因素關系的研究[J].寧夏醫學雜志，2018，40（3）：243-245，192.

[20]應一櫻，陳潔，朱飛波.老年IgA腎病患者不同部位血管內皮生長因子水平及其與尿蛋白的相關性[J].中國老年學雜志，2014，34（7）：1823-1825.

[21]李佩宏，李文奇.IgA腎病患者尿蛋白和血管內皮生長因子的相關性研究[J].重慶醫學，2014，43（8）：918-921.

[22]雷俊峰.IgA腎病腎小球微血管損傷和修復與中介素相關性研究[D].太原：山西醫科大學，2017.

[23]王文廣，李卉，劉曉鷹.金水清治療IgA腎病模型大鼠的實驗研究[J].湖北中醫藥大學學報，2016，18（5）：12-14.

[24]周欽，曹文富，李榮亨.大劑量黃芪注射液對慢性腎功能不全患者血漿、尿液內皮素的影響[J].中國中藥雜志，2001，26（3）：56-58.

[25]王林群，李卉，劉曉鷹.金水清對IgA腎病大鼠細胞凋亡Fas/FasL系統的影響[J].湖北中醫藥大學學報，2018，20（6）：5-9.

[26]王林群，李卉，劉曉鷹.金水清對IgA腎病大鼠細胞凋亡和Bcl-2、Bax表達的影響[J].湖北中醫雜志，2019，41（1）：5-8.

[27]陳暢.金水清對系膜增生性腎炎濕熱證血尿大鼠NF-κB、TGF-β1表達的影響[D].武漢：湖北中醫藥大學，2017.

（2020-03-25收稿 責任編輯：徐穎）