養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)認(rèn)知功能障礙大鼠學(xué)習(xí)、記憶及GAP-43、PSD-95表達(dá)的影響

葉海森 陳曦 李韌嬌

摘要 目的：探討?zhàn)B血清腦顆粒對(duì)認(rèn)知功能障礙大鼠學(xué)習(xí)、記憶及GAP-43、PSD-95表達(dá)的影響。方法：采用雙側(cè)頸動(dòng)脈永久性結(jié)扎法構(gòu)建認(rèn)知功能障礙大鼠模型，將大鼠隨機(jī)分為模型組與實(shí)驗(yàn)組，每組18只。假手術(shù)組（n=15）大鼠僅分離、暴露頸動(dòng)脈，不結(jié)扎。實(shí)驗(yàn)組灌胃養(yǎng)血清腦顆粒10 mL/（kg·d），假手術(shù)組與模型組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)干預(yù)4周。測(cè)定各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力;HE染色觀察大鼠海馬組織病理學(xué)變化;TUNEL檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡情況;Wb法檢測(cè)海馬組織GAP-43和PSD-95蛋白表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期與游泳路程延長(zhǎng)，跨越原平臺(tái)次數(shù)減少，記憶成績(jī)下降，神經(jīng)元凋亡指數(shù)與海馬組織PSD-95蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，而GAP-43蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，且以上指標(biāo)實(shí)驗(yàn)組均優(yōu)于模型組（均P<0.05）。結(jié)論：養(yǎng)血清腦顆粒可改善認(rèn)知功能障礙大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，抑制神經(jīng)元凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)海馬組織GAP-43蛋白表達(dá)，下調(diào)PSD-95蛋白表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞 認(rèn)知功能障礙;養(yǎng)血清腦顆粒;學(xué)習(xí);記憶;GAP-43;PSD-95

Abstract Objective：To investigate the effects of Yangxue Qingnao Granules on learning，memory and expression of GAP-43 and PSD-95 in rats with cognitive impairment.Methods：A bilateral carotid artery permanent ligation was used to construct the rat models of cognitive dysfunction，and the rats with cognitive impairment were randomly divided into a model group and a test group，with 18 rats in each group.Rats in the sham-operation group（n=15）only isolated and exposed the carotid arteries without ligation.Rats in the test group were administered with Yangxue Qingnao Granules 10 mL/（kg·d） by gavage.The sham-operation group and the model group were perfused with the same amount of normal saline，and the intervention was continued for 4 weeks.The learning and memory ability of rats were detected in each group; histopathological changes in hippocampus of rats by HE staining was observed; TUNEL was used to detect hippocampal neuron apoptosis in each group of rats; Wb method was used to detect the protein expression of GAP-43 and PSD-95 in hippocampus of rats.Results：Compared with the sham-operation group，the escape latency and swimming distance of the model group were significantly longer，the number of times to cross the original platform significantly reduced，the memory score significantly decreased，the apoptosis index of hippocampal neurons and the relative expression of PSD-95 protein in the hippocampus significantly increased in the model group，but the relative expression of GAP-43 protein significantly reduced，and the above indicators were better in the test group than in the model group（all P<0.05）.Conclusion：Yangxue Qingnao Granules can improve the learning and memory ability，inhibit neuronal apoptosis，and its mechanism may be related to up-regulating the expression of GAP-43 protein and down-regulating the expression of PSD-95 protein in hippocampus.

Keywords Cognitive dysfunction; Yangxun Qingnao Granules; Learning; Memory; GAP-43; PSD-95

血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）是指由各種腦血管因素引起的腦組織損害，并伴有嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙的綜合征，是一種慢性的進(jìn)行性疾病，屬于中醫(yī)學(xué)“癡呆”范疇，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚無(wú)有效的治療手段[1-2]。近年來(lái)，中藥在VD治療中的作用逐漸引起關(guān)注。養(yǎng)血清腦顆粒是在中醫(yī)名方“四物湯”的基礎(chǔ)上改良而成的中藥復(fù)方制劑，具有滋陰養(yǎng)血、活血通絡(luò)、平肝潛陽(yáng)等功效，臨床上常用于治療腦血管疾病[3]。文獻(xiàn)[4]報(bào)道，養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)慢性腦供血不足患者認(rèn)知功能障礙及腦血流均有改善，且安全有效，但具體的作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在探討?zhàn)B血清腦顆粒對(duì)大鼠雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎所致認(rèn)知功能障礙的改善作用及其作用機(jī)制，以期為其臨床推廣應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)，雄性SD大鼠，6～7周齡，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)于賽業(yè)模式生物研究中心（太倉(cāng)）有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0003。飼養(yǎng)環(huán)境：飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，每5只1籠，溫度（25±2）℃，濕度（55±2）%，光照明暗時(shí)間比為12 h/12 h，自由獲取食物和水。

1.1.2 藥物 養(yǎng)血清腦顆粒（天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10960082）。

1.1.3 試劑與儀器 蘇木精-伊紅（HE）染色液（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：bs-0061R）;TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）凋亡試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：T2190）;兔抗鼠生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43（GAP-43）抗體（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab16053）;兔抗鼠突觸后致密物質(zhì)-95（PSD-95）抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：150409）等。切片機(jī)（上海億欣生物科技有限公司，KD-2800型）;臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，5417R型）;倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司，DMI30B1型）;多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司，M200 PRO型）;QuantityOne 1-D分析軟件（美國(guó)Bio-Rad公司）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用雙側(cè)頸動(dòng)脈永久性結(jié)扎的方法構(gòu)建認(rèn)知功能障礙大鼠模型：10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，頸前部備皮。頸正中線(xiàn)左側(cè)旁開(kāi)0.5 cm處行長(zhǎng)約1 cm切口，鈍性分離頸總動(dòng)脈，4號(hào)絲線(xiàn)雙重結(jié)扎;7 d后于頸正中線(xiàn)右側(cè)旁開(kāi)0.5 cm處行同樣切口，并進(jìn)行相同手術(shù)操作。另選擇15只大鼠作為假手術(shù)組，僅做頸前切口，將雙側(cè)頸動(dòng)脈分離、暴露，但不結(jié)扎。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)判斷認(rèn)知功能障礙大鼠模型是否構(gòu)建成功，連續(xù)5 d，計(jì)算模型鼠逃避潛伏期均值與參考值（假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期5 d的均值）之差以及差值與該均值的比值，若比值>20%，即表示造模成功。將成功建立的36只認(rèn)知功能障礙大鼠隨機(jī)分為模型組及實(shí)驗(yàn)組，每組18只[5]。

1.2.2 給藥方法 實(shí)驗(yàn)組大鼠給予養(yǎng)血清腦顆粒[10 mL/（kg·d），濃度為0.32 g/mL]灌胃，假手術(shù)組與模型組等量生理鹽水灌胃，3組均連續(xù)干預(yù)4周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[6]與Y型迷宮實(shí)驗(yàn)[7]測(cè)定大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力 1）末次干預(yù)后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：a.定位航行試驗(yàn)：將大鼠依次從4個(gè)象限放入水中，記錄120 s內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期）;若大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，逃避潛伏期記為120 s。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，取平均值。b.空間搜索試驗(yàn)：撤除平臺(tái)，計(jì)算大鼠120 s內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)及游泳的軌跡。2）Y型迷宮實(shí)驗(yàn)：a.學(xué)習(xí)能力測(cè)試：大鼠放入Y型迷宮適應(yīng)5 min后施加電刺激（電壓60 V，延時(shí)5 s）。大鼠受到電擊后一次性逃往安全區(qū)判為正確反應(yīng)，并讓其在安全區(qū)停留30 s。當(dāng)大鼠連續(xù)10次訓(xùn)練中有9次正確反應(yīng)，則表示學(xué)習(xí)合格。記錄大鼠達(dá)到9/10標(biāo)準(zhǔn)前所需的訓(xùn)練次數(shù)，以表征其學(xué)習(xí)成績(jī)。b.記憶能力測(cè)試：訓(xùn)練結(jié)束后24 h，按上述方法訓(xùn)練大鼠10次，記錄正確反應(yīng)次數(shù)作為記憶成績(jī)，以評(píng)價(jià)記憶能力的高低。

1.2.3.2 HE染色[8]觀察大鼠海馬組織病理學(xué)變化各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，分離、采集海馬組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織病理學(xué)特點(diǎn)。

1.2.3.3 TUNEL法[9]檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況 取石蠟切片，按照TUNEL凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。細(xì)胞核染為綠色為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，于倒置熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3.4 蛋白免疫印跡（Wb）法[10]檢測(cè)大鼠海馬組織GAP-43、PSD-95蛋白的表達(dá)水平 取-80 ℃保存的海馬組織，加入裂解液在冰浴環(huán)境中勻漿，4 ℃條件下，12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取待測(cè)蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉，加入一抗GAP-43、PSD-95，4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗。采用QuantityOne 1-D圖像處理分析軟件分析各條帶的灰度值，以目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值確定目的蛋白相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組短于模型組;跨越原平臺(tái)次數(shù)明顯減少，實(shí)驗(yàn)組多于模型組;游泳路程明顯延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組短于模型組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠Y型迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠達(dá)到9/10標(biāo)準(zhǔn)所需的訓(xùn)練次數(shù)明顯增加，且實(shí)驗(yàn)組少于模型組（P<0.05）;記憶成績(jī)明顯下降，實(shí)驗(yàn)組高于模型組（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化 假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)完整，排列整齊、緊密;模型組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)異常，結(jié)構(gòu)不清晰，排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)減少，且細(xì)胞核固縮，部分出現(xiàn)空泡變性現(xiàn)象;實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞上述形態(tài)學(xué)改變較模型組均明顯減輕。見(jiàn)圖1。

2.4 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況 假手術(shù)組、模型組與實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡指數(shù)分別為（11.41±2.37）%、（54.32±4.78）%、（37.43±4.21）%。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡指數(shù)明顯升高，且實(shí)驗(yàn)組低于模型組（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.5 各組大鼠海馬組織GAP-43、PSD-95蛋白的表達(dá)水平 假手術(shù)組、模型組與實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬組織GAP-43蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.95±0.05）、（0.13±0.06）、（0.51±0.12），PSD-95蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.06±0.04）、（0.96±0.04）、（0.25±0.11）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織GAP-43蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，且實(shí)驗(yàn)組高于模型組（P<0.05）;PSD-95蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，且實(shí)驗(yàn)組低于模型組（P<0.05）。見(jiàn)圖3。

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為VD屬中風(fēng)后癡呆范疇，其基本病機(jī)是腎虛髓虧，常發(fā)于老年人;而VD的發(fā)病基礎(chǔ)是腎精漸衰，腦髓失養(yǎng)，加之中風(fēng)后腦絡(luò)瘀阻，氣血精津阻滯，導(dǎo)致痰、瘀、濁毒停滯腦髓，腦竅失充，使元神失養(yǎng)，清竅不清，從而出現(xiàn)神思遲鈍、善忘等癥狀[11]。VD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜且尚未完全明確，因此臨床上可用于治療VD的有效藥物較少。近年來(lái)，中醫(yī)藥在治療VD方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，養(yǎng)血清腦顆粒是采用最新工藝，在中醫(yī)傳統(tǒng)名方四物湯的基礎(chǔ)上加減而成的現(xiàn)代中藥，其主要成分是當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃、鉤藤、雞血藤、延胡索、夏枯草、決明子、珍珠母、細(xì)辛等，其中當(dāng)歸補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛;川芎活血行氣、白芍滋陰養(yǎng)血;熟地黃益精填髓，補(bǔ)血滋陰;鉤藤清熱平肝，息風(fēng)止痙;雞血藤、延胡索化瘀行氣，舒筋通絡(luò)，補(bǔ)血活血，養(yǎng)血祛風(fēng);夏枯草清肝火，解郁結(jié);決明子潤(rùn)腸通便，清肝明目;珍珠母清熱平息肝風(fēng)，潛陽(yáng)安神;細(xì)辛散風(fēng)通竅止痛，全方具有平肝潛陽(yáng)、養(yǎng)血活血的作用[12]。研究[13]發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)血清腦顆粒可改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，對(duì)VD有治療作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠逃避潛伏期與游泳路程均縮短，跨越原平臺(tái)次數(shù)明顯增多，同時(shí)達(dá)到9/10標(biāo)準(zhǔn)所需的訓(xùn)練次數(shù)明顯減少，而記憶能力升高，提示養(yǎng)血清腦顆粒可改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。樓小亮等[14]研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)血清腦顆粒可減輕缺血再灌注腦損傷大鼠腦梗死體積，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化，從而利于神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡指數(shù)低于模型組，提示養(yǎng)血清腦顆粒可抑制海馬神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)功能損害，進(jìn)而改善學(xué)習(xí)、記憶能力。

GAP-43是一種胞膜磷酸蛋白質(zhì)，與神經(jīng)再生、突觸可塑性及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育密切相關(guān)，當(dāng)其表達(dá)水平降低時(shí)，可損傷神經(jīng)系統(tǒng)功能，從而影響學(xué)習(xí)記憶能力;PSD-95可參與突觸可塑性的調(diào)節(jié)和興奮性突觸信號(hào)傳遞，其表達(dá)增加可產(chǎn)生興奮性毒性損傷，導(dǎo)致血管性認(rèn)知功能障礙[15-16]。文獻(xiàn)[17]顯示，褪黑素可通過(guò)上調(diào)GAP-43蛋白表達(dá)，改善神經(jīng)可塑性，促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。目前尚未見(jiàn)關(guān)于養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)GAP-43或PSD-95作用的相關(guān)研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬組織PSD-95蛋白相對(duì)表達(dá)量低于模型組，GAP-43蛋白相對(duì)表達(dá)量高于模型組，提示養(yǎng)血清腦顆粒可上調(diào)VD大鼠海馬組織GAP-43蛋白表達(dá)，下調(diào)PSD-95蛋白表達(dá)，從而減輕神經(jīng)損傷，改善學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，養(yǎng)血清腦顆粒可改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，抑制神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)損傷，其機(jī)制可能與上調(diào)海馬組織GAP-43蛋白表達(dá)，下調(diào)PSD-95蛋白表達(dá)相關(guān)，這為臨床治療VD提供了新方向，也為養(yǎng)血清腦顆粒的推廣應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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（2020-03-02收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）