家兔軟骨細胞復(fù)合藻酸鹽體外培養(yǎng)的實驗研究

劉 義，楊 浩，吳 迪，李 驊，趙智君

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032；2.重慶渝北區(qū)人民醫(yī)院骨科，重慶 401120）

關(guān)節(jié)軟骨缺乏血供，基質(zhì)中軟骨細胞稀疏，缺乏分裂增生能力，其自身修復(fù)能力有限，關(guān)節(jié)軟骨損傷通常會引發(fā)嚴(yán)重的關(guān)節(jié)軟骨退變。在關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療中，臨床采用的技術(shù)包括骨髓刺激術(shù)（軟骨下骨鉆孔、微骨折等）、同種骨軟骨移植、馬賽克軟骨移植及基于自體軟骨細胞移植的ACI和MACI。骨髓刺激術(shù)通常在局部形成纖維軟骨，而結(jié)合ACI或者MACI，可以形成透明軟骨樣組織，具有較好的遠期效果[1]。MACI基于組織工程技術(shù)，將體外擴增的自體軟骨細胞種植于支架材料中進行移植，其關(guān)鍵技術(shù)在于軟骨細胞的分離培養(yǎng)及制備理想的支架材料。

1 材 料

1.1 實驗動物

取昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供的6只成年新西蘭大白兔，周領(lǐng)34～37周，體重1.8～2.2 kg。

1.2 主要試劑和儀器（見表1）

表1 主要儀器和試劑

2 方 法

2.1 軟骨細胞獲取

取6只成年新西蘭大耳白兔（昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），體重1.8～2 kg，空氣栓塞處死，切取股骨內(nèi)、外側(cè)髁軟骨，置入裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿中。

生理鹽水沖洗軟骨塊三遍，使用手術(shù)刀片將其切為0.5 mm3大小的碎粒，用吸管移入離心管中1000 rpm離心10 min，去上清液，加入十倍左右的0.1﹪Ⅱ型膠原酶置入培養(yǎng)箱消化8小時，可見軟骨顆粒大部分消化，取出后，放入恒溫搖床中，37℃ 120 r/min消化1小時，可見軟骨顆粒完全消化。l000 rpm離心10 min，棄上清，沉淀用30倍的PBS平衡液清洗、離心3遍后，在高糖DMEM完全培養(yǎng)基中加入，其含谷氨酰胺292 mg/L+維生素C 50 mg/L+10%胎牛血清+1%雙抗液，混勻后，轉(zhuǎn)移至25 ml普通培養(yǎng)瓶中，在37℃、5﹪CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)?！?br>