凡納濱對蝦miRNA-184克隆與表達分析

梁金榮，許鑾佳，李 玲，郭 慧，申玉春

凡納濱對蝦克隆與表達分析

梁金榮，許鑾佳，李 玲，郭 慧，申玉春

（廣東海洋大學水產學院 / 湛江市海洋生態與養殖環境重點實驗室，廣東 湛江 524025）

【目的】研究凡納濱對蝦（）miRNA-184 [microRNA-184（miR-184），記作]在健康蝦及染病蝦中的表達，探討其免疫功能。【方法】用莖環法克隆鑒定凡納濱對蝦，通過熒光定量PCR檢測在對蝦血淋巴、肝胰腺、鰓、肌肉、心臟、胃、腸和眼柄等8個組織中的分布。對凡納濱對蝦注射副溶血弧菌（），檢測不同時間點的響應變化。對感染副溶血弧菌的凡納濱對蝦分別注射0.3、3.0和30.0 ng的miR-184模擬物和抑制物，檢測不同時間點對蝦血細胞凋亡率。【結果與結論】在所有組織中均有表達，在胃中表達量最高，其次是肌肉，鰓表達量最低。注射副溶血弧菌后1.5 h，表達量顯著上調；在24 h達到峰值，較對照組高8.25倍；對照組則維持在較低的水平。模擬物、抑制物注射量為30 ng時對蝦血細胞凋亡率差異有統計學意義（<0.05）；與對照組凋亡率相比，注射模擬物6 h后提高62 %。可調控凡納濱對蝦的血細胞凋亡。

凡納濱對蝦；microRNA；基因克隆；基因表達；細胞凋亡

凡納濱對蝦 () 具有市場需求量大、經濟價值高、肉質鮮美等優點[1]。但對蝦規模化養殖帶來病害頻發問題，嚴重制約了對蝦養殖業的發展[2]。因此研究對蝦病害機制，對促進對蝦產業健康發展有重要意義。

miRNA 是一種由17 ~ 25個核苷酸組成的非編碼RNA[3]，其生物調控作用廣泛，囊括細胞的分化、增殖、凋亡等過程[4]；miRNA與信使RNA（mRNA）轉錄原理相近，作為一種內源RNA，miRNA有轉錄后調控的特性[5]，主要表現為抑制mRNA翻譯或者降解mRNA[6-7]。對蝦有強大的非特異性免疫系統[8]，血淋巴為主要的免疫器官之一，在病原體入侵時，血細胞主要以吞噬、包囊和形成結節等方式發揮免疫作用[9]。血細胞程序性凋亡是對蝦保持內環境穩態、對抗病菌入侵的方式之一[10]。有研究表明，日本囊對蝦（）miRNA（）介導誘發血細胞凋亡在對蝦對抗WSSV感染中起作用[11]，斑節對蝦（）感染WSSV后，miR-184（）也發生明顯變化[11]，推測miR-184可能與白斑綜合征感染有關。關于miR-184在對蝦中的功能需進一步研究。筆者克隆凡納濱對蝦（記作），通過實時熒光定量PCR研究組織表達特征和應答副溶血弧菌（）的表達模式，探究在對蝦血細胞凋亡的調控作用，為對蝦抗病免疫機制探索及其病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細菌原液

凡納濱對蝦體質量（12.0 ± 0.5）g，取自湛江市東海島養殖基地。在規格為0.5 m× 0.8 m × 0.5 m的水族箱中暫養7 d，海水鹽度24，水溫26 ~ 29 ℃，保持連續充氣；每日按照對蝦體質量5%投喂3次，日換水量1/4。副溶血弧菌由廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室贈送，于–80℃下超低溫保存。

1.2 總RNA提取及cDNA的合成

采用Trizol 試劑盒（Invitrogen，貨號15596018，美國）提取總RNA。用10 mg/mL的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA，并用Nanodrop 2000 超微量核酸蛋白測定儀（Thermo Scientific，美國）檢測濃度和質量。所有 RNA 樣品各取1 μg，按照PrimeScript? RTreagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 試劑盒（TaKaRa, RR047A，日本），根據龐鑫等[12]改進方法，用miR-184 RT（50 μmol/L）取代試劑盒中的RT Primer Mix合成cDNA。

1.3 MicroRNA-184測序及鑒定

根據凡納濱對蝦miRNA文庫[13]獲取miR-184成熟體序列，根據成熟序列運用primer 5軟件設計引物、miR-184 mimics和miR-184 inhibitors，并送往上海生工生物技術有限公司合成（表1）。采用2 × PCR master MIX（上海生工）進行克隆擴增。PCR反應體系：2 × PCR master MIX 25 μL，miR- F 2 μL，miR-184R 2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 19 μL。擴增程序：95 ℃ 1.5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，40個循環；最后72 ℃下延伸1 min。取PCR產物2 μL 用聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）確認目的片段。將剩余PCR產物送往上海生工生物技術有限公司用miR-F引物進行測序。

表1 引物

1.4 凡納濱對蝦miR-184組織表達

取健康凡納濱對蝦9尾，暫養1周后分別取血淋巴、肝胰腺、鰓、肌肉、心臟、胃、腸和眼柄等8個組織于凍存管中保存，按照每3尾蝦的組織混合成一管，實驗設定3個重復，所取組織于液氮速凍保存備用；注射器用ACD抗凝劑（檸檬酸0.48 g、檸檬酸鈉1.32 g、葡萄糖1.47 g，用雙蒸水定容至100 mL，過濾滅菌）潤洗后抽出血淋巴，以4 ℃、6 000 r/min條件離心5 min，吸去上清，加入500 μL TRIzol，混勻，于– 80 ℃下保存。RNA提取和cDNA合成根據1.2進行。熒光定量PCR反應體系：2× SYBR Green Mix (TOYOBO, Japan) 12.5 μL，miR-F 1 μL，miR-184 R 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應條件：95 ℃ 1.5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，40個循環；最后72 ℃下延伸1 min。收集數據以進行后續分析。

1.5 感染副溶血弧菌后凡納濱對蝦miR-184的表達

在凡納濱對蝦第4步足基部注射濃度為1× 107、1× 108、1× 109CFU/mL的副溶血弧菌，確定24 h半致死濃度（LC50）為1× 109CFU/mL。同法對凡納濱對蝦以LC50攻毒，分別收集0、1.5、3、6、12、24、48、72 h的肝胰腺（72 h時，因存活蝦數量已無法滿足取樣所需，無法得到72 h的組織表達結果）于液氮速凍，按照1.2方法進行總RNA提取和cDNA的合成。

1.6 模擬物和抑制物注射量確定

用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理過的磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋模擬物和抑制物，設梯度為0.01、0.10和1.00 ng/μL；實驗分為7組，記為C、m1、m2、m3、i1、i2、i3組，每組蝦9尾，注射量為30 μL。對C組注射1×PBS；m1、m2、m3組按照設定梯度注射模擬物；i1、i2、i3組按設定梯度注射抑制物，注射24 h后收集肝胰腺于液氮速凍，按照1.2方法進行總RNA提取和cDNA的合成；PCR體系：2 × PCR master MIX 25 μL，miR- F 2 μL，miR-184 R 2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 19 μL。擴增程序：95 ℃ 1.5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，40個循環；最后72 ℃下延伸1 min。取PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳確認目的片段。

1.7 MiR-184過表達和抑制表達對血細胞凋亡的影響

對感染副溶血弧菌的凡納濱對蝦分別注射模擬物和抑制物30 ng，6 h后，按照卓宏標等[14]方法，取蝦9尾，每尾抽取血淋巴200 μL，按體積比1∶1與ACD抗凝劑混合，于冰上保存備用。通過Annexin V/PI apoptosis kit（聯科生物，AP101）試劑盒檢測血細胞凋亡，按照試劑盒方案進行冰上避光染色30 min，用流式細胞術檢測細胞凋亡率，設定儀器讀取10 000個細胞，每管血淋巴重復檢測3次。血細胞凋亡率計算：

血細胞凋亡率（%）=（Annexin V FITC光密度值+ PI光密度值）/ 10 000。

1.8 數據處理

熒光定量數據通過2-ΔΔCT法[7]計算相對表達量，所得數據采用SPSS18.0進行單因素方差分析，并運用Duncan法進行多重比較，通過Excel作圖。

2 結果

2.1 LvmiR-184克隆鑒定

PAGE結果顯示，PCR產物長度約60 bp（圖1），符合預期長度，電泳條帶單一且明亮清晰。測序結果顯示，miR-184成熟體（mature miR-184）序列（5′–TGGACG GAGAACTGATAAGGGT–3′）與本課題組建立的miRNA文庫[13]吻合。

M，DNA maker DL 600；C，空白對照；U6，U6內參；184，miR-184

2.2 凡納濱對蝦LvmiR-184組織表達分析

在8個組織中的表達情況見圖2。結果表明，在所有組織中均有表達，在胃中表達量最高，其次是肌肉，鰓的表達量最低。

**，與鰓組織比較< 0.01

圖2 凡納濱對蝦在不同組織的表達

Fig. 2 Expression ofin different tissues

2.3 感染副溶血弧菌后凡納濱對蝦miR-184的響應

注射1× 109CFU/mL菌液0、1.5、3、6、12、24、48 h時表達結果見圖3。與各時間點對照組相比，注射弧菌1.5 h后，開始上調（< 0.01），24 h時達到峰值，其中1.5 h上調3.47倍，24 h上調 8.25倍。

**，與對照組比較P < 0.01

2.4 模擬物和抑制物注射量確定

由圖4A可見，注射30 ng的模擬物組電泳條帶的亮度明顯高于其他組；由圖4B可見注射30 ng的抑制物組條帶亮度較暗，與i1、i2組、對照組區別不明顯；30 ng的注射量可達到過表達目的，該注射量可用于后續實驗。

M, DL 2000 DNA 分子標記；c, 對照組；m1, 0.3 ng模擬物；m2, 3 ng模擬物；m3, 30 ng模擬物；u6, u6內參；i1, 0.3 ng抑制物；i2, 3 ng抑制物；i3, 30 ng抑制物

2.5 LvmiR-184過表達和抑制表達對血細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果如圖5、6所示。結果表明，過表達顯著提升血細胞的凋亡率（< 0.01），注射模擬物后，相對于對照組，血細胞凋亡率提升顯著。注射抑制物后未能顯著降低血細胞的凋亡率（>0.05）。

**，與對照組比較P < 0.01

A，注射弧菌；B，注射弧菌+抑制物；C，注射弧菌+模擬物

A, vibrio injection; B, vibrio + inhibitor injection; C, vibrio + mimics injection

圖6 流式細胞術檢測血淋巴凋亡情況

Fig. 6 Flow cytometry for detection of hemocyte apoptosis

3 討論

在哺乳動物中，可調節干細胞的增殖與分化、癌癥的發生、細胞凋亡等過程[15-16]。Wang等[17]發現，可被活性氧(reactive oxygen species, ROS) 氧化，氧化后的miR-184與Bcl-xL和Bcl-w錯配，進而引發細胞凋亡。劉秀娟[18]發現，miR-184有調節大鼠 () 腎小球系膜細胞衰老進程作用。此外，Xu等[19]研究發現，克氏原螯蝦（）在投喂大黃素后出現明顯的差異表達，表明可能參與了甲殼動物的生長、代謝等過程。本研究克隆鑒定凡納濱對蝦，在眼柄、肝胰腺和胃等組織中高表達，表明可能參與對蝦機體內多種調控作用。

Yang[20]研究表明，在日本囊對蝦（）對抗白斑病毒感染中表達量變化較大；Ou等[21]研究發現，克氏原螯蝦在受到蟹螺原體（）刺激后表達量顯著上調；Xu Peng等[22]發現，河南華溪蟹（）在應對鎘（Cd）誘導的氧化應激反應中顯著上調。上述研究結果表明，在甲殼動物中具有潛在的免疫功能。本研究發現，用副溶血弧菌攻毒凡納濱對蝦后，注射后1.5 h時，表達顯著上調，并持續到實驗結束，表明具有免疫調節功能。

本研究中，以成熟體為模板設計合成模擬物和抑制物，設定注射量為30 ng；通過注射模擬物發現在凡納濱對蝦體內的含量明顯增加，而注射抑制物未能降低在凡納濱對蝦體內的含量表明注射模擬物可產生過表達作用。注射抑制物抑制表達作用不明顯，可能原因是合成抑制物未加3′ 端化學修飾，使得抑制物無法與發生競爭性結合或者結合。Hughes等[23]發現，模擬物在人類眼角膜中形成有效的過表達濃度為15 ng，與本研究不同，可能是因為物種間對microRNA的敏感度不同。在甲殼動物中，對蝦僅有非特異性免疫系統，其免疫功能包括吞噬、包囊等；血淋巴作為對蝦非特異性免疫器官之一，在對抗病菌、異物入侵等免疫過程起重要作用[9,24]。吞噬、包囊作用發生后，細胞開始程序性凋亡是保持機體內穩態的一個重要的機制[25-26]。本研究表明，過量表達可增加血細胞凋亡率，表明可能參與了凡納濱對蝦細胞凋亡途徑；抑制表達未顯著降低血細胞凋亡率，結合結果2.4發現注射30 ng的抑制物效果不理想，未能抑制的表達，導致抑制物注射組血細胞凋亡率與對照組不顯著。

研究結果為了解對蝦抗病免疫機制，進而防治對蝦病害提供參考。

[1] 王銨靜, 楊奇慧, 譚北平, 等. 大豆酶解蛋白對凡納濱對蝦幼蝦生長性能、血清生化指標、非特異性免疫力和抗病力的影響[J]. 廣東海洋大學學報, 2018, 38(1): 14-21.

[2] 黃雪敏, 梁華芳, 薛明, 等. 凡納濱對蝦爛尾病病原的分離鑒定及藥敏分析[J]. 廣東海洋大學學報, 2019, 39(4): 42-48.

[3] 楊浩. miR-140-5p通過靶向調節TGFBR1和FGF9抑制肝細胞癌增殖和侵襲轉移[D]. 長沙：中南大學, 2013. http://kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CDFD&filename=1013358098.nh.

[4] 陳輝, 王賽, 汪麗娜. microRNA-214在心臟保護作用的研究進展[J]. 湖北科技學院學報(醫學版), 2019, 33(6): 543-547.

[5] 閘雯俊, 常萌, 游艾青. microRNA對昆蟲生長和發育的調控[J]. 湖北農業科學, 2019, 58(22): 198-202；210.

[6] 成磊. miRNA介導靶基因沉默的分析與識別[D]. 南京：南京航空航天大學, 2011. http://cdmd.cnki.com.cn/ Article/CDMD-10287-1011292071.htm

[7] 池明. 采用人造小RNA技術抑制馬鈴薯多酚氧化酶的研究[D]. 楊凌：西北農林科技大學, 2014. http://cdmd. cnki.com.cn/Article/CDMD-10712-1015513129.htm.

[8] 陶夢圓, 李長平, 倫鏡盛, 等. 源于凡納濱對蝦血藍蛋白的化學合成肽段的免疫調控活性[J]. 中國水產科學, 2019, 26(5): 844-851.

[9] 章雙, 黎銘, 董曉慧, 等. 凡納濱對蝦輸入蛋白α1基因的克隆與表達分析[J]. 廣東海洋大學學報, 2016, 36(3): 1-8.

[10] 盧芷程, 許鑾佳, 盧文宇, 等. 溶藻弧菌對凡納濱對蝦血細胞毒性及細胞凋亡和免疫相關基因的影響[J]. 南方農業學報, 2018, 49(12): 2559-2565.

[11] KAEWKASCHOLKUL N, SOMBOONVIWATB K, ASAKAWA S, et al. Shrimp miRNAs regulate innate immune response against white spot syndrome virus infection[J]. Developmental & Comparative Immunology, 2016, 60: 191-201.

[12] 龐鑫, 馬春林, 廖世奇, 等. 小鼠肝臟MicroRNA的提取與分離[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2011, 27(11): 1067-1072.

[13] GUO H, LU Z C, ZHU X W, et al. Differential expression of microRNAs in hemocytes from white shrimpunder copper stress[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2018, 74: 152-161.

[14] 卓宏標, 鄭秋耀, 梁華芳, 等. 波紋龍蝦蛻殼周期的呼吸排泄和血淋巴生理學[J]. 廣東海洋大學學報, 2019, 39(5): 24-30.

[15] LIU C M, TENG Z Q, SANTISTEVAN N J, et al. Epigenetic regulation of miR-184 by MBD1 governs neural stem cell proliferation and differentiation[J]. Cell Stem Cell, 2010, 6(5): 433-444.

[16]EMDAD L, JANJIC A, AlZUBI M A, et al. Suppression of miR-184 in malignant gliomas upregulates SND1 and promotes tumor aggressiveness[J]. Neuro-Oncology, 2015, 17(3): 419-429.

[17] WANG J X, GAO J, DING S L, et al. Oxidative modification of miR-184 enables it to target Bcl-xL and Bcl-w[J]. Molecular Cell, 2015, 59(1): 50-61.

[18] 劉秀娟. MiR-184和miR-150通過靶向自噬基因促進腎臟系膜細胞衰老[D]. 北京：中國人民解放軍醫學院, 2014. http://kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode =CDFD&dbname=CDFD&filename=1015521650.nh.

[19] XU W N, LIU W B, YANG W W, et al. Identification and differential expression of hepatopancreas microRNAs in red swamp crayfish fed with emodin diet[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2014, 39(1): 1-7.

[20] YANG L, YANG G, ZHANG X B. The miR-100-mediated pathway regulates apoptosis against virus infection in shrimp[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2014, 40(1): 146-153.

[21] OU J T, LI Y, DING Z F, et al. Transcriptome-wide identification and characterization of themicroRNAs potentially related to immunity againstinfection[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2013, 35(2): 607-617.

[22] XU P, GUO H Q, WANG H H, et al. Identification and profiling of microRNAs responsive to cadmium toxicity in hepatopancreas of the freshwater crab[J]. Hereditas, 2019, 156(1): 34.

[23] HUGHES A E, BRADLEY D T, CAMPBELL M, et al. Mutation altering the miR-184 seed region causes familial keratoconus with cataract[J]. The American Journal of Human Genetics, 2011, 89(5): 628-633.

[24] 蘭萍, 宋曉玲, 張輝, 等. 美人魚發光桿菌對凡納濱對蝦非特異性免疫功能及抗病力的影響[J]. 漁業科學進展, 2010, 31(1): 65-73.

[25] GREEN D R. The end and after: how dying cells impact the living organism[J]. Immunity, 2011, 35(4): 441-444.

[26] SUN R, QIU L M, YUE F, et al. Hemocytic immune responses triggered by CpG ODNs in shrimp[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2013, 34(1): 38-45.

Molecular Cloning and Expression Analysis of MicroRNA-184 in the White Shrimp ()

LIANG Jin-rong, XU Luan-jia, LI Ling, GUO Hui, SHEN Yu-chun

（,/,524025,）

【Objective】To study the expression of microRNA-184 innamed, and explore its immunologic function.【Method】MicroRNA-184 was cloned and identified by stem-loop method from. The distribution ofin eight tissues and the response changes ofat different times after injected withwas detected by qPCR. The apoptosis ratios of hemocyte ofwhich were infected with, were detected after being injected withmimics and inhibitors of 0.3, 3.0, and 30.0 ng, respectively. 【Result and Conclusion】was expressed in all tissues, with the highest expression in the stomach, followed by the muscle and gill. The expression ofin shrimp infected withwas significantly increased after 1.5 h and reached a peak at 24 h, which was 8.25 times higher than the control; while the control. The results indicated that when the injected amount was 30 ng; it was significantly difference (< 0.05) in the apoptosis rate of shrimp hemocyte, after injection of the mimics or inhibitor. Compared with the control group, the apoptosis rate has increased by 62% at 6 h after injection of the mimics. The results indicate thatcan regulate hemocyte apoptosis in.

; microRNA; gene cloning; gene expression; hemocyte apoptosis

Q78；Q959.223+.63

A

1673-9159（2020）04-0015-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.04.003

2020-02-20

國家自然科學基金(31600321）

梁金榮（1992－），男，碩士研究生，研究方向為養殖環境保護。E-mail: 981061344@qq.com

申玉春（1964－），男，博士，教授，研究方向為海洋環境與生物資源保護。E-mail: shenyuchun@163.com

梁金榮，許鑾佳，李玲，等. 凡納濱對蝦克隆與表達分析[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（4）：15-20.

（責任編輯：劉慶穎）