羅非魚唾液酸黏附素基因克隆及組織表達

牛繼敏，牛金中,2,3，黃 瑜,2,3，簡紀常,2,3，王 蓓,2,3，魯義善,2,3

羅非魚唾液酸黏附素基因克隆及組織表達

牛繼敏1，牛金中1,2,3，黃 瑜1,2,3，簡紀常1,2,3，王 蓓1,2,3，魯義善1,2,3

（1. 廣東海洋大學水產學院 // 2. 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室 //3. 廣東省水產經濟動物病害控制重點實驗室，廣東 湛江 524088）

【目的】研究尼羅羅非魚（）唾液酸黏附素（）在健康魚及感染無乳鏈球菌（）后的組織表達，探討其在免疫反應中的作用。【方法】根據NCBI上公布的羅非魚唾液酸黏附素基因（GenBank登錄號LOC102078335，記為）克隆開放閱讀框序列，采用實時熒光定量PCR技術檢測在健康羅非魚脾臟、頭腎、腸道、皮膚、鰓、腦、肌肉、肝、胸腺、脾、外周血中的分布，以及無乳鏈球菌（）刺激后的表達。【結果與結論】基因編碼區1 617 bp，編碼538個氨基酸，理論分子質量59.44 ku，等電點6.57。含有3個IG結構域和1個IGC2，是IG結構域蛋白質超級家族成員。多序列比對發現，與其他物種氨基酸序列同源性介于36.81% ~ 92.94%，且與奈里樸麗魚（）同源性最高。系統進化分析發現，與慈鯛科魚的聚為一支。在健康羅非魚各組織中均有表達，在頭腎和外周血中表達量最高，其余組織表達量相對較低。經無乳鏈球菌刺激后，表達量在10個組織中均呈現顯著的時序性。

尼羅羅非魚；唾液酸黏附素；基因；克隆；表達；無乳鏈球菌

尼羅羅非魚（）屬熱帶性魚類，其肉質細嫩，味道鮮美，具生長與繁殖力強、抗病性和適應能力強等特點，在我國南方地區廣泛養殖[1]。然而，隨著養殖密度的增加，養殖環境惡化，羅非魚相關病害也隨之增加，如無乳鏈球菌病、羅湖病毒病，給羅非魚養殖產業造成巨大的經濟損失[2-6]。因此，研究羅非魚免疫系統及免疫應答有重要意義，有助于其疫苗的研發。

唾液酸黏附素(又稱Siglec-1或CD169，屬于免疫球蛋白超家族類黏附分子，主要表達于單核巨噬細胞和樹突狀細胞上，參與單核巨噬細胞介導的促炎癥反應及T淋巴細胞的激活[7]。還可作為吞噬性受體結合和清除含唾液酸結構的病原體[8]。哺乳動物唾液酸黏附素分子質量約185 ku，其結構高度保守，胞外區域有17個免疫球蛋白樣結構域[9]，用于介導細胞與細胞間黏附。胞內缺乏用于信號傳導的免疫受體酪氨酸抑制基序（Immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motifs，ITIM）。目前，有關魚類唾液酸黏附素的研究只是在基因組中預測該基因，而關于唾液酸黏附素與其配體的相互作用機制、胞內信號轉導機制以及其他生物功能仍未完全闡明。深入探索唾液酸黏附素的分子結構和生物機制對于進一步了解免疫調節機制、干預免疫調節過程均有重要意義。本研究基于羅非魚唾液酸黏附素基因（記作）在NCBI上公布預測的全長序列設計引物，克隆與預期一致的開放閱讀框（ORF），并通過熒光定量PCR的方法對其組織表達模式，以及細菌刺激后該基因在羅非魚體內的各個組織表達變化展開研究，以期初步了解唾液酸黏附素在羅非魚免疫系統中所發揮的作用，為后續蛋白純化、抗體制備提供技術支持，并為進一步研究免疫球蛋白樣凝集素家族在硬骨魚先天免疫中的重要作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用尼羅羅非魚約150 g，采自廣東海洋大學東海島基地，在30℃左右條件下暫養7 d后用于實驗。大腸桿菌（）DH5 α和無乳鏈球菌（）ZQ0910菌種由由廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室提供。qPCR 試劑盒（TransStart Green qPCR SuperMix）、RNA提取試劑盒（TransZol Up Plus RNA Kit）、cDNA合成試劑盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）購自北京全式金公司。PCR引物由生工生物工程股份有限公司合成，Premix Taq? Version 2.0、載體pMD18-T購自TaKaRa公司（大連），DNA回收純化試劑盒（ThermoScientific GeneJET）購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 羅非魚總RNA提取和cDNA合成 對無乳鏈球菌刺激組腹腔注射濃度為1×107cfu/mL的無乳鏈球菌0.1 mL，對照組腹腔注射0.1 mL的磷酸鹽緩沖液（PBS）[10]，各組分別在注射后0、6、12、24、48、72、96 h隨機取羅非魚3尾，取脾臟、頭腎、腸道、皮膚、鰓、腦、肌肉、肝、胸腺、脾、外周血等10個組織，放入TransZol中，根據TransZol Up Plus RNA Kit說明書提取羅非魚各組織RNA。按照北京全式金公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明書將羅非魚10組織總RNA反轉錄成cDNA，用于基因克隆和不同組織表達分析。

1.2.2 羅非魚基因的分子克隆 根據NCBI上公布的的基因序列(LOC102078335)，以1.2.1制備的羅非魚頭腎cDNA為模板，用PrimerPremier 5.0設計引物Sial-1F、Sial-1617R（表1），進行PCR擴增，反應體系（20 μL）：Premix Taq 10 μL，ddH2O 7.5 μLcDNA 模板0.5 μL，Sial -1F、Sial-1617各1 μL。PCR反應條件：94 ℃5 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃60s，34個循環；72 ℃ 10min，4 ℃下保存[11]。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后對其進行切膠回收，目的條帶與pMD 18-T載體連接，連接成功后轉化至DH5α感受態細胞中，涂布于Amp+的LB瓊脂平板上，倒置在37 ℃恒溫培養箱內培養8 ~10 h，挑選單菌落于含Amp+的LB液體培養基中，于37℃、160r/min 條件下培養4 h，用通用引物M13和RV（表1）進行菌落PCR鑒定，將陽性克隆送至生工生物公司測序。

表1 引物

1.2.3 qRT-PCR檢測的表達 參考文獻[12]方法。首先利用的特異性引物sial-RT595F、sial-RT758R（表1），以β-actin為內參基因，用ABI 7500 Real-Time定量PCR儀檢測在各個組織以及不同刺激后的表達。qPCR參照TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒說明書進行，反應體系：TransStart Top Green qPCR SuperMix 5 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，dH2O 3.5 μL。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40個循環。每個樣本設置3個復孔。用2-ΔΔCt法[13]計算相對表達量。用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，數據用平均值±標準差表示。

1.2.4 用軟件分析陽性克隆結果 對克隆獲得的序列用NCBI (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)進行比對分析；利用TMHMM Server 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM) 預測跨膜結構域；用Inter ProScan Sequence search (http://www.ebi.ac.uk/Tools)和SMART (http://smart. embl-heidelberg.de/) 預測蛋白功能結構域；用Clutalx和Genedoc軟件進行氨基酸同源序列比對。蛋白質二級、三級結構的預測網址分別為PORTER (http://www.distill. ucd.ie/porter)、SWISSM-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/interactive)。使用ExPASy ProtParam tool (http://web.expasy.org/ protparam/）進行On-sialoadhesin氨基酸序列推導和相關理化性質分析。通過MEG7.0軟件，用鄰接法構建系統進化樹。

2 結果

2.1 On-sialoadhesin基因克隆與序列分析

基因PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得與預期基因一致的片段，為1 617 bp（圖1），編碼538個氨基酸殘基。

M，DL2000 DNA 分子標準; 1，目的基因

經預測，第395～417位氨基酸存在跨膜結構域（圖2）；第1～17位為信號肽區域，其中信號肽剪切位點在第17～18位氨基酸之間；該序列功能位點（圖3）有細胞附著序列1個，N-糖基化位點6個，酪蛋白激酶 II 磷酸化位點12個，蛋白激酶C磷酸化位點9個，酪氨酸激酶磷酸化位點3個，N-豆蔻酰化位點9個，C-末端靶向信號序列7個，異戊二烯基結合位點4個；蛋白的分子式為C2632H4095N717O818S18，分子質量59.44 ku，理論等電點6.57，偏酸性，絲氨酸（Ser）13.6%，亮氨酸（Leu）8.4%，纈氨酸（Val）8.4%，蘇氨酸（Thr）6.5%，總平均親水性（GRAVY）為–0.323。半衰期為30 h，不穩定指數為44.24，脂肪指數為80.02，根據Guruprasad方法[14]，為不穩定蛋白。

圖2 On-sialoadhesin基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列和功能位點

2.2 On-sialoadhesin蛋白二級結構和三級結構預測

圖4可見，蛋白二級結構以無規則卷曲為主，其中，α-螺旋53個，占總鏈的35.33%，無規則卷曲76個，占總鏈的50.67%，β-轉角18個占總鏈的12%，延伸鏈3個，占總鏈的2%。對蛋白進行同源模建，獲其三級結構模型，其最佳模型是5lfu.1.A（圖5），序列一致性為20.87%；另一模型是3laf.1A，序列一致性為20.18%。

2.3 On-sialoadhesin序列同源比對及進化分析

將克隆的基因序列與金頭鯛（）、伯氏樸麗魚（）、雀鳥（）、三趾箱龜（）、泰國斗魚（）、揚子鱷（）、奈里樸麗魚（）、斑馬擬麗魚（）、大黃魚（）等相應的基因序列進行相似性比對，其中羅非魚與里樸麗魚序列相似性高達92.75%，與泰國斗魚序列相似性為67.85%（表2）。構建的羅非魚唾液酸黏附素基因系統進化樹見圖6，結果顯示，尼羅羅非魚與同屬慈鯛科的樸麗魚屬和擬麗魚屬魚的親緣性最近，其次是泰國斗魚，而與揚子鱷和三趾箱龜等物種相距最遠。羅非魚與慈鯛科各屬魚的聚為1支，同源性較高。

藍色是α-螺，紅色是β-轉角，綠色是延伸鏈，紫色是無規則卷曲

圖5 On-sialoadhesin蛋白蛋白跨膜區三維結構

表 2 序列相似性

2.4 On-sialoadhesin在羅非魚各組織中的分布

的各組織表達檢測結果（圖7）顯示，在健康羅非魚的10個組織中均有表達，在頭腎和外周血中表達量最高，其余組織表達量較低。

圖6 鄰接法構建的On-sialoadhesin進化樹

L：肝；Hk：頭腎；Br：腦；In：腸；Sk：皮膚；M：肌肉；Sp：脾；Th：胸腺；G：鰓；B：外周血；On-sialoadhesin水平在肝臟中設為1

2.5 無乳鏈球菌攻毒后On-sialoadhesin在羅非魚組織中的表達

圖8可見，無乳鏈球菌攻毒后，在頭腎中，12、24 h時顯著升高（＜0.05），96 h時極顯著降低（＜0.01）。在腦組織中，攻毒后6 h顯著下降（＜0.05），12 h和48 h時顯著增加（＜0.01），24 h時恢復至正常水平，而在72、96 h時極顯著降低(< 0.01)。在皮膚中，6 h時極顯著增加（＜0.01），12、48 h時恢復至正常水平，而在24、72 h時顯著下降（＜0.05），96 h時極顯著降低(< 0.01)。在鰓組織中，攻毒后6、12 h時顯著增加（＜0.05），24 h時恢復正常水平，而在48、72、96 h時顯著降低（＜0.05）。在肌肉組織中，攻毒后12 h和48 h時極顯著增加（＜0.01）而在24 h時極顯著降低（＜0.01）。在脾臟中，攻毒后12、24、48和72 h時顯著增加（＜0.05），96 h恢復至正常水平。在腸組織中，攻毒后6、48 h時極顯著增加（＜0.01），72 h時顯著增加（＜0.05），而在12 h時極顯著降低（＜0.05），在24、96 h時恢復至正常水平。在肝臟中，6、24和48 h時顯著增加（＜0.05），在72、96 h時顯著下降（＜0.05），而在12 h時恢復至正常水平，而在72、96 h時顯著降低（＜0.05）。在胸腺中，攻毒后24、48 h時顯著增加（＜0.05），其他時間無顯著差異。在外周血中，攻毒后24 h時極顯著增加（＜0.01），而在6、12、48、72和96 h時均呈現顯著降低（＜0.05）。綜上，攻毒后在頭腎、皮膚、鰓、脾臟、胸腺組織中總體上呈先升后降變化，而在腦、肌肉、腸、肝臟、外周血中變化規律不明顯，其在所有組織中的表達量均在不同時間升至最大值。

*，與0 h（對照）比較P < 0.05；**，與0 h（對照）比較P < 0.01；On-sialoadhesin在各個對照中的表達量均設為1

3 討論

本研究成功克隆基因，獲得1 617 bp的ORF序列，編碼538個氨基酸殘基。在推導的序列中發現3個IG結構域和一個IGC2結構域，這些結構域在其他動物該蛋白中也存在[15-16]。免疫球蛋白（IG）是機體受抗原刺激后，由淋巴細胞特別是漿細胞合成的一類有抗體活性或化學結構與抗體相似的球蛋白[17-19]，主要存在于血液和其他分泌液中，也可作為抗原識別受體存在于B細胞膜上。主要功能是特異性結合抗原、活化補體、結合Fc受體、調理吞噬作用、發揮抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用[20-22]。序列相似性和系統進化樹分析中與奈里樸麗魚序列相似性高達92.75%，其他不同物種的同源性差，但其中許多功能位點較為保守，系統進化樹分析表明，與慈鯛科魚的聚為1支，親緣性關系相對較近（圖6）。可見，本研究所得序列是Siglecs家族的一員。

唾液酸黏附素在豬免疫器官攻毒實驗顯示，在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、下頜淋巴結和腸系膜等中7 d達最高值，心臟非免疫組織表達量最低。在人類Siglec-1冠心病患者外周血Siglec-1 (CD169) 的基因表達水平，實驗組均顯著高于健康對照組，表明不同物種唾液酸黏附素基因在免疫組織上的表達仍有相似性[23-24]。本研究中，在健康尼羅羅非魚各組織中均有表達，但不同組織間表達量差異較大，其中在頭腎和外周血中表達量最高，其次是腸、肝臟、脾臟、皮膚、鰓、肌肉、胸腺，在腦中表達量最低。免疫細胞是魚類進行免疫應答的結構基礎[26]，羅非魚頭腎含有單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、粒細胞等免疫細胞[25]，是羅非魚重要免疫器官之一，外周血也含有淋巴細胞、單核細胞等免疫細胞；在羅非魚免疫器官或組織中的高表達可表明其在羅非魚免疫方面的有重要功能。無乳鏈球菌是羅非魚的重要致病菌，目前，魚類唾液酸黏附素應無乳鏈球菌刺激的時序表達研究相對較少。本研究通過腹腔注射無乳鏈球菌誘導表達，發現其在頭腎、皮膚、鰓、脾臟、胸腺組織中總體上呈先升后降變化，而在腦、肌肉、腸、肝臟、外周血中變化規律不明顯，在所有組織中表達量均在感染后不同時間升至最大值。由此推測，可能參與了羅非魚抗菌的感染免疫，在羅非魚體抵抗無乳鏈球菌感染過程中發揮了重要作用。該基因在各組織中達到最高表達量的時間上有較大差別。可能與無乳鏈球菌刺激時免疫系統發揮時間的長短和作用機理有關。具體原因還有待進一步研究。

4 結論

本研究成功克隆基因ORF序列，通過結構域分析、序列比對和系統進化樹分析，所得基因是Siglecs家族中的一員。在健康羅非魚各組織中均有表達，經無乳鏈球菌攻毒后，在脾臟、腸、頭腎、肝臟、腦、皮膚、肌肉、胸腺、外周血和鰓等10個組織中表達量均有顯著性變化，推測可能參與羅非魚抗菌感染免疫。

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Cloning and Expression Analysis of Sialoadhesin Gene inNile Tilapia ()

NIU Ji-min1, NIU Jin-zhong1,2,3, HUANG Yu1,2,3, JIAN Ji-chang1,2,3, WANG Bei1,2,3, LU Yi-shan1,2,3

（1.// 2.// 3.,524088,）

【Objective】To study the expression ofgene in healthy and sick tilapia () challenged by, and explore the role ofin the immune response of Nile tilapia. 【Method】The open reading frame ofgene (was cloned according to the sequence published on NCBI (GenBank accession number LOC102078335). Real-time quantitative PCR was used to detect the distribution ofin spleen, head kidney, intestine, skin, gill, brain, muscle, liver, thymus, and blood and its expression afterstimulation. 【Result and Conclusion】The coding region ofgene was 1 617 bp, encoding 538 amino acids, with a theoretical molecular mass of 59.44 ku and an isoelectric point of 6.57.contains three IG domains and an IGC2 domain, belongs to the IG domain protein superfamily. Multiple sequence alignments revealed thatshare high sequence homology withof other species ranging from 36.81% to 92.94% and have the highest homology with. Phylogenetic analysis revealed thatandclustered together. Real-time quantitative PCR analysis showed thatwas expressed in all examined tissues of healthy tilapia, with the highest expression in head kidney and peripheral blood. The expression ofin all tissues showed significant time-dependent manner postinfection.

;; gene; clone; expression;

Q78；Q959.483；S941.42

A

1673-9159（2020）04-0021-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.04.004

2020-01-30

國家自然科學基金青年基金項目（31702386）；廣東省科技廳國際科技合作領域項目（2017A050501037）

牛繼敏（1989—），女，碩士研究生，研究方向為水產經濟動物病害防治。E-mail:1018829854@qq.com

簡紀常（1964—），男，教授，研究方向為水產經濟動物病害防治。E-mail: jianjc@ gdou.edu.cn

黃瑜（1986—），男，博士，研究方向為魚類免疫學。E-mail：huangyu@gdou.edu.cn

牛繼敏，牛金中，黃瑜，等. 羅非魚唾液酸黏附素基因克隆及組織表達[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（4）：21-28.

（責任編輯：劉慶穎）