食管鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)miRNA的生物信息學(xué)分析

曹詩茹， 李 琰， 周榮秒， 黃 茜， 霍向然， 王 娜

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院分子生物學(xué)研究室， 河北 石家莊 050011)

食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是食管癌的一種主要組織學(xué)類型，發(fā)病率和病死率均居我國惡性腫瘤前列。早期診斷率低和侵襲性強(qiáng)是食管癌高死亡率的主要原因。所以，需要進(jìn)一步研究食管鱗癌的生物標(biāo)志物和分子機(jī)制。MicroRNAs是一種單鏈非編碼RNA，約23個(gè)核苷酸。miRNAs的失調(diào)可導(dǎo)致惡性腫瘤,而miRNAs發(fā)揮致癌作用或抑癌作用因其靶向的mRNAs類型而異。隨著基因芯片和RNA測序技術(shù)的迅速發(fā)展，基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫在生物信息學(xué)分析中發(fā)揮著重要作用，它可以為我們發(fā)現(xiàn)功能性miRNA提供線索。本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫中食管鱗癌miRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)GSE114110，篩選食管鱗癌及正常食管上皮組織的差異表達(dá)miRNA(differentially expressed miRNAs， DE-miRNAs)，并預(yù)測其靶基因，對靶基因進(jìn)行聚類分析及功能富集分析，利用Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)，篩選Hub基因并構(gòu)建miRNA-Hub gene網(wǎng)絡(luò)，旨在進(jìn)一步鑒定食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵miRNA及其靶基因，為食管鱗癌篩選分子標(biāo)志物及進(jìn)一步明確發(fā)病分子機(jī)制提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1研究工具和對象：通過對美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information， NCBI)GEO數(shù)據(jù)庫中食管鱗狀細(xì)胞癌miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選,選取GSE114110 miRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)為研究對象，該芯片為Agilent-038169 human miRNA，安捷倫GPL24967平臺。GSE114110數(shù)據(jù)集包括30例食管鱗癌組織及10例正常食管上皮組織。

1.2差異miRNA分析:應(yīng)用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)對GSE114110數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，對兩組實(shí)驗(yàn)條件相同的樣品進(jìn)行對比，篩選DE-miRNAs。本研究所設(shè)定的閾值為P<0.05，|logFC|≥2。

1.3篩選驗(yàn)證數(shù)據(jù)集并對差異miRNA進(jìn)行驗(yàn)證:在GEO數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞 “Esophageal squamous cell carcinoma”和“ESCC”進(jìn)行搜索，設(shè)定非編碼RNA數(shù)據(jù)并設(shè)定物種為人類，確定32個(gè)數(shù)據(jù)集。納入標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)數(shù)據(jù)集包括ESCC樣本組和對照樣本組(健康食管組織、相鄰非癌組織)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①僅有l(wèi)ncRNAs和circRNAs數(shù)據(jù)，無miRNAs數(shù)據(jù)；②缺乏正常對照組。最后納入GSE97049, GSE59973, GSE55856 和 GSE43732。

1.4預(yù)測靶基因:通過miRNet(https://www.mirnet.ca/miRNet/faces/home.xhtml)分別對前三位上調(diào)和下調(diào)的差異miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測。

1.5靶基因的功能富集:將篩選所得的6個(gè)DE-miRNAs預(yù)測的靶基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID ( https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行功能注釋和通路富集分析，包括GO分析和KEGG通路分析。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6PPI網(wǎng)絡(luò)和miRNA-Hub gene網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建:分別構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和miRNA-Hub gene網(wǎng)絡(luò)。首先將靶基因映射到STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)，以評估靶基因之間的功能關(guān)聯(lián)，并選擇可信度評分>0.7的交互作用進(jìn)行下一步研究。利用Cytoscape軟件分析PPI網(wǎng)絡(luò)的連通性，獲得Hub基因，建立miRNA-Hub gene網(wǎng)絡(luò)。

1.7Hub基因的表達(dá)驗(yàn)證:starBase(http://starbase.sysu.edu.cn/panCancer.php)是一種包含了來源于TCGA數(shù)據(jù)庫中腫瘤組織表達(dá)數(shù)據(jù)的在線分析網(wǎng)站。本研究應(yīng)用starBase數(shù)據(jù)分析工具對Hub基因進(jìn)行表達(dá)水平的驗(yàn)證。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:使用上述各種數(shù)據(jù)分析軟件，對所得的各種數(shù)據(jù)信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1食管鱗癌和正常食管上皮組織中DE-miRNAs的篩查及其靶基因的預(yù)測:使用GEO2R分析GSE114110數(shù)據(jù)集，結(jié)果顯示共篩查出159個(gè)差異倍數(shù)達(dá)4倍以上的DE-miRNAs，其中上調(diào)的miRNA86個(gè)，下調(diào)的miRNA73個(gè)，并繪制了這些DE-miRNAs的火山圖(圖1)，列出了上調(diào)幅度最大的10個(gè)miRNA和下調(diào)幅度最大的10個(gè)miRNA(表1、表2)。根據(jù)fold change (FC)， 上調(diào)幅度最大的3個(gè)miRNA分別是hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-196b-5p和hsa-miR-34c-5p；下調(diào)幅度最大的3個(gè)miRNA分別是hsa-miR-133a、hsa-miR-1和hsa-miR-4770。將這6個(gè)DE-miRNAs在食管鱗狀細(xì)胞癌miRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集GSE97049, GSE59973, GSE55856 和 GSE43732中進(jìn)行驗(yàn)證，與前期分析一致(表3)。通過miRNet預(yù)測出3個(gè)上調(diào)miRNA的514個(gè)潛在靶基因及3個(gè)下調(diào)miRNA的1186個(gè)潛在靶基因(圖2)。

2.2靶基因的功能富集:利用DAVID對上述靶基因進(jìn)行功能富集分析，包括生物學(xué)過程(BP)、細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF)三類GO功能注釋分析。如圖3a1-a3所示，三種上調(diào)miRNA的靶基因主要參與的生物學(xué)過程(BP)為調(diào)控細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等；主要參與的細(xì)胞組成(CC)為膜結(jié)構(gòu)、核質(zhì)等；主要參與的分子功能(MF)為蛋白的結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子的活性、DNA結(jié)合等。圖3b1-b3展示了三種下調(diào)miRNA的靶基因主要參與的生物學(xué)過程(BP)為蛋白質(zhì)的定位和運(yùn)輸、肌動蛋白細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等；主要參與的細(xì)胞組成(CC)為各種膜結(jié)構(gòu)等；主要參與的分子功能(MF)為肌動蛋白結(jié)合、細(xì)胞骨架內(nèi)蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等。為了進(jìn)一步分析這些靶基因的富集途徑，我們進(jìn)行了KEGG通路富集分析。上調(diào)miRNA的靶基因富集到的KEGG通路包括癌癥通路、黏著斑、p53信號通路等(圖4a)。下調(diào)miRNA的靶基因富集到的KEGG通路包括癌癥通路、黏著斑等(圖4b)。重要的是，上調(diào)miRNA的靶基因和下調(diào)miRNA的靶基因都富集于黏著斑通路,黏著斑調(diào)節(jié)異常在細(xì)胞侵襲和遷移中起著重要作用。因此,上調(diào)miRNA的靶基因中與黏著斑通路相關(guān)的21個(gè)基因(ACTB, PIK3CG, CAV1, VAV3, MAP2K1, MET, ITGA11, ITGB3, FLNA, VCL, AKT1, MAPK1, IGF1R, CCND1, LAMB2, CCND2, ITGAV, BCL2, PDGFRA, PDGFRB, PTENP1)和下調(diào)miRNA的靶基因中與黏著斑通路相關(guān)的32個(gè)基因(PDGFB, XIAP, ERBB2, ITGB4, CDC42, IGF1R, SOS2, PIK3CA, THBS1, THBS2, PIK3R2, FN1, EGFR, ACTB, ACTN4, MET, ITGA1, ACTN1, IGF1, ITGA3, FLNC, FLNB, FLNA, VASP, MAPK1, CCND1, ITGA6, VEGFA, RAP1B, COL1A1, CRK, PARVA)和上述篩選出的6個(gè)miRNA相互作用,從而調(diào)節(jié)食管鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)和miRNA-Hub基因網(wǎng)絡(luò)的分析:將篩選獲得的6個(gè)DE-miRNAs的靶基因輸入STRING網(wǎng)站，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步應(yīng)用Cytoscape軟件分析靶基因之間的連通度，并篩選出前十名，為Hub基因(表4)。上調(diào)DE-miRNAs的hub基因?yàn)镸APK1、MYC、AKT1、HSP90AA1、POLR2D、CCND1、SMAD4、HIST1H2BB、HIST1H2BD、CDKN1B。下調(diào)DE-miRNAs的hub基因?yàn)镸APK1、EGFR、CDC42、POLR2K、PIK3CA、KRAS、POLR2I、HIST2H2AC、FN1、VEGFA。在這些基因中，MAPK1節(jié)點(diǎn)度最高。結(jié)果表明，MAPK1可能是食管鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。隨后，利用Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA-Hub gene網(wǎng)絡(luò)，如圖5所示。從圖5a中我們發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-196a-5p可能調(diào)控10個(gè)hub基因中的7個(gè)(MAPK1、MYC、POLR2D、CCND1、HIST1H2BB、HIST1H2BD、CDKN1B)。6個(gè)hub基因和5個(gè)hub基因可能分別被hsa-miR-196b-5p和hsa-miR-34c-5p調(diào)控。此外，hsa-miR-1可能調(diào)控10個(gè)hub基因中的9個(gè)(EGFR、CDC42、POLR2K、PIK3CA、KRAS、POLR2I、HIST2H2AC、FN1、VEGFA)。其中4個(gè)hub基因和1個(gè)hub基因可能被hsa-miR-133a和hsa-miR-4770調(diào)控(圖5b)。這些數(shù)據(jù)支持hsa-miR-196a-5p和hsa-miR-1可能是食管鱗狀細(xì)胞癌的兩個(gè)潛在調(diào)控因子。

2.4Hub基因的表達(dá)水平驗(yàn)證:應(yīng)用starBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步驗(yàn)證hsa-miR-196a-5p和hsa-miR-1在ESCC中靶基因的表達(dá)情況，如圖6所示。分析結(jié)果表明，hsa-miR-196a-5p的7個(gè)靶基因中5個(gè)(MYC、POLR2D、CCND1、HIST1H2BB、HIST1H2BD)的表達(dá)在ESCC組織中較正常組織明顯上調(diào)。而hsa-miR-1的9個(gè)靶基因中7個(gè)(CDC42、POLR2K、PIK3CA、POLR2I、HIST2H2AC、FN1、VEGFA)的表達(dá)在ESCC組織中較正常組織明顯上調(diào)， miRNA表達(dá)與靶基因表達(dá)之間存在著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這一點(diǎn)已被廣泛認(rèn)識，因此，顯著上調(diào)的7個(gè)基因可能是下調(diào)hsa-miR-1的靶點(diǎn)。

表2 正常上皮組織和ESCC組織中差異表達(dá)miRNA下調(diào)前10位

表3 DE-miRNAs在食管鱗狀細(xì)胞癌miRNA表達(dá) 譜芯片數(shù)據(jù)集GSE97049 GSE59973 GSE55856 GSE43732中的差異表達(dá)

圖1 火山圖(黑點(diǎn)代表30個(gè)ESCC樣品和10個(gè)NE樣品中無差異表達(dá)的miRNA，紅點(diǎn)和綠點(diǎn)分別代表ESCC樣品中上調(diào)和下調(diào)的miRNA)

圖2 前三位上調(diào)和前三位下調(diào)miRNA的靶基因(a前三個(gè)上調(diào)miRNA;b前三個(gè)下調(diào)miRNA)

圖3 前3位上調(diào)和前3位下調(diào)miRNA靶基因的GO功能

圖4 六個(gè)DE-miRNA靶基因的KEGG通路富集分析

表4 PPI網(wǎng)絡(luò)中連通度位列前十的Hub基因

圖5 前3位上調(diào)和前3位下調(diào)miRNA及其Hub基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖6 starbase工具驗(yàn)證分析hsa-miR-196a-5p和hsa-miR-1靶基因的mRNA表達(dá)

3 討 論

隨著科技的進(jìn)步，越來越多的新技術(shù)被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是基因芯片和高通量測序技術(shù)。通過生物信息學(xué)方法分析腫瘤相關(guān)大數(shù)據(jù)，為腫瘤研究提供了幫助。本研究通過從GEO數(shù)據(jù)庫下載食管鱗狀細(xì)胞癌miRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集GSE114110，分析差異表達(dá)miRNAs，得到6個(gè)與食管鱗癌相關(guān)的miRNA，預(yù)測其靶基因，并對靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。結(jié)果顯示三種上調(diào)miRNA的靶基因主要參與了細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學(xué)過程，這些生物學(xué)過程的異常會造成細(xì)胞的過度增殖、低分化細(xì)胞的出現(xiàn)和蛋白的異常表達(dá)。三種下調(diào)miRNA的靶基因主要參與了肌動蛋白細(xì)胞骨架等細(xì)胞組成；蛋白質(zhì)的定位和運(yùn)輸、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程；肌動蛋白結(jié)合、細(xì)胞骨架內(nèi)蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等分子功能。這些都是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的生物學(xué)基礎(chǔ)。KEGG通路還發(fā)現(xiàn)上調(diào)miRNA的靶基因和下調(diào)miRNA的靶基因都富集于癌癥通路和黏著斑通路。因此,上調(diào)miRNA的靶基因中與黏著斑通路相關(guān)的21個(gè)基因與下調(diào)miRNA的靶基因中與黏著斑通路相關(guān)的32個(gè)基因和篩選出的6個(gè)miRNA相互作用,從而調(diào)節(jié)食管鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

篩選連通度最高的前十個(gè)靶基因?yàn)镠ub基因，構(gòu)建了miRNA-Hub gene網(wǎng)絡(luò)。我們發(fā)現(xiàn)hsa-miR-196a-5p和hsa-miR-1可調(diào)控大部分Hub基因。研究表明miR-196a在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，通過靶向ANXA1調(diào)控食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，miR-196a/ANXA1軸可能是食管癌潛在的治療靶點(diǎn)[1]。Mona等指出miR-196a在ESCC患者唾液樣本中較健康組表達(dá)上調(diào)，其靶基因多富集在黏著斑通路和p53信號通路，為研究食管癌非侵襲性檢測標(biāo)志物指明了方向[2]。hsa-miR-1在許多惡性腫瘤中均低表達(dá)，是一種抑癌基因。研究顯示hsa-miR-1可以靶向Notch2基因調(diào)節(jié)EMT信號通路，抑制食管癌細(xì)胞遷移、侵襲[3]。杜彥艷等證實(shí)食管癌中hsa-miR-1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分型和血管浸潤有關(guān)，并通過結(jié)合靶基因LASP1和TAGLN2抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。本文通過篩選和表達(dá)驗(yàn)證，確定CDC42、POLR2K、PIK3CA、POLR2I、HIST2H2AC、FN1、VEGFA在ESCC組織中明顯上調(diào)，與hsa-miR-1存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，可能是其靶點(diǎn)。纖維連接蛋白FN主要在食管鱗癌間質(zhì)中高表達(dá)，并與患者預(yù)后不良密切相關(guān)。腫瘤間質(zhì)FN高表達(dá)改變食管鱗癌細(xì)胞的形態(tài)和遷移能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[5]。hsa-miR-1可以靶向FN1基因抑制食管癌細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]。PI3K-Akt是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)途徑，在細(xì)胞生長、增殖、凋亡、血管生成等過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。PIK3CA是PI3K-Akt信號通路中關(guān)鍵的原癌基因，PIK3CA突變可導(dǎo)致激酶活性增強(qiáng)，刺激下游AKT,增加細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力[7]。有研究證明miR-1高表達(dá)抑制了食管癌細(xì)胞的生長，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低了PIK3CA蛋白的表達(dá)水平。此外，miR-1過表達(dá)增加了食管癌細(xì)胞對抗癌藥物吉非替尼的敏感性，其機(jī)制可能是PIK3CA信號通路失活[8]。Chou等發(fā)現(xiàn)miR-1能與CDC42 3'UTR結(jié)合并抑制其表達(dá)，在誘導(dǎo)乳腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用；MALAT1也可通過競爭性結(jié)合miR-1影響CDC42的表達(dá)，MALALT1、miR-1和CDC42共同調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲[9]。血管內(nèi)皮生長因子VEGF-A是血管生成的關(guān)鍵調(diào)控因子，通過抑制血管生成信號通路從而影響血管生成是許多實(shí)體腫瘤的重要治療方法。hsa-miR-1可通過抑制VEGFA和EDN1的表達(dá)，降低胃癌細(xì)胞的惡性度和血管內(nèi)皮的生成，從而發(fā)揮抑癌作用[10]。

綜上所述，通過分析miRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)GSE114110獲得差異表達(dá)miRNA hsa-miR-1及與其表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的靶基因CDC42、POLR2K、PIK3CA、POLR2I、HIST2H2AC、FN1、VEGFA，這些基因在某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，可能成為ESCC基因治療的潛在靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究提供理論指導(dǎo)。