燒傷科患者分離金黃色葡萄球菌耐藥性和耐藥基因分析*

付曉蕊，康蓓佩，徐修禮，馬越云，周 磊

空軍軍醫大學西京醫院檢驗科/全軍臨床檢驗醫學研究所，陜西西安 710032

燒傷在人們的生活中時有發生。燒傷創面由于存在大量的壞死與變性組織，使得皮膚作為人體抵御微生物入侵的天然屏障被破壞，容易引起細菌定植，當細菌入侵到皮膚表面的滲出液或者壞死組織并且達到一定數量時，就會出現化膿性感染、膿毒癥等全身癥狀[1]。常見的感染病原體為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌及其他腸道陰性桿菌，尤其是當燒傷患者受到金黃色葡萄球菌感染時，更易引發全身化膿性感染或者毒素性疾病。20世紀60年代歐洲確認了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)后，各種各樣的耐藥菌株相繼出現，且其耐藥范圍日益擴大，耐藥程度日益嚴重。20 世紀90 年代后期又出現了耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌(VRSA)[2]及萬古霉素中介金黃色葡萄球菌(VISA)[3]。本文著重分析本院燒傷科患者創面分泌物分離的金黃色葡萄球菌的耐藥性和耐藥基因分布，旨在為臨床醫生挑選有效抗菌藥物、促進患者恢復健康提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年10月至2019年4月本院燒傷科分離的135株金黃色葡萄球菌，標本均為燒傷創面分泌物，剔除同一患者的重復標本。質控菌株ATCC25923、ATCC29213、ATCC43300由國家衛生健康委員會臨床檢驗中心提供，于本室保存。

1.2方法

1.2.1菌種鑒定和藥敏試驗 采用法國生物梅里埃VITEK-Ⅱ Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統，藥敏試驗的解釋標準、結果判讀參照2018年美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)標準。

1.2.2細菌基因組DNA制備 無菌條件下將收集的金黃色葡萄球菌接種在血瓊脂平板上，35 ℃培養箱中培養18～24 h，挑取6～8個單個菌落置于0.5 mL無菌生理鹽水中，充分震蕩混勻，95 ℃煮沸15 min，12 000 r/min離心5 min后取上清液即為所需粗提細菌基因組DNA溶液。

1.2.3PCR基因擴增 反應體系共25 μL，包括Premix Tap緩沖液12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，蒸餾水9.5 μL。反應過程：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共循環35次，結束后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。耐藥基因引物序列及擴增片段長度[1]見表1。

表1 PCR引物序列和產物長度

續表1 PCR引物序列和產物長度

1.2.4產物檢測 取5 μL擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用紫外凝膠成像系統觀察結果。

1.3統計學處理 應用WHONET5.6統計學軟件進行數據分析，統計金黃色葡萄球菌的耐藥率、中介率和敏感率。

2 結 果

2.1金黃色葡萄球菌耐藥率 分析135株燒傷患者分泌物標本金黃色葡萄球菌藥敏檢測結果，其對多種抗菌藥物耐藥，只對少數藥物敏感。其中對青霉素的耐藥率為97.0%，對利福平耐藥率為72.6%，對慶大霉素、紅霉素、克林霉素和四環素耐藥率均超過60.0%；對利奈唑胺、萬古霉素、替考拉寧、奎奴普汀/達福普利和替加環素都高度敏感，敏感率均為100.0%，對復方磺胺甲噁唑和莫西沙星的敏感率分別高達92.6%和85.9%，對左氧氟沙星的敏感率為65.9%，具有較好的抗菌活性。見表2。

表2 135株金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的耐藥率、中介率和敏感率(%)

2.2MRSA和MSSA相關抗菌藥物的耐藥率及耐藥基因檢測情況 基因檢測mecA基因陽性可以判斷為MRSA，本試驗檢測中有73株金黃色葡萄球菌為MRSA，62株金黃色葡萄球菌為對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)。在135株金黃色葡萄球菌中，耐藥基因以mecA、ermA、ermC和aac6′/aph2′為主。β-內酰胺類抗菌藥物相關耐藥基因mecA、TEM檢測陽性率分別是54.1%和32.6%，大環內酯類相關耐藥基因ermA、ermB、ermC檢測陽性率分別為51.9%、28.1%、62.2%，氨基糖苷類相關耐藥基因ant6、aac6′/aph2′基因檢測陽性率分別為17.0%、62.2%，見表3。在135株金黃色葡萄球菌中73株為MRSA，62株為MSSA。MRSA和MSSA對β-內酰胺類抗菌藥物苯唑西林耐藥率分別為100.0%、0.0%，對大環內酯類抗菌藥物代表藥物紅霉素的耐藥率分別為78.1%、46.8%，對氨基糖苷類抗菌藥物代表藥物慶大霉素的耐藥率分別為93.2%、40.3%，與相關耐藥基因比較基本一致，主要還是以mecA、ermA、ermC和aac6′/aph2′為主，見表4。

表3 MRSA和MSSA的耐藥基因陽性率

表4 MRSA和MSSA相關抗菌藥物的耐藥情況

3 討 論

燒傷患者創面存在大量的壞死與變性組織，創面周圍常有紅腫、出血點或壞死斑，當機體全身營養支持療法不當、蛋白質攝入不足致使機體長期消耗容易引起細菌感染。近些年抗菌藥物的大量使用使得金黃色葡萄球菌對抗菌藥物耐藥率持續增加，燒傷創面感染越發難以恢復[4]，甚至于在MRSA出現以后，已經嚴重威脅到患者生命。MRSA同時對多種抗菌藥物耐藥，有氨基糖苷類、β-內酰胺類、利福霉素類、喹諾酮類、大環內酯類、林可胺類等，這也是臨床抗感染治療的一大難題[5-6]。

本研究藥敏結果顯示，135株金黃色葡萄球菌對多數抗菌藥物耐藥率較高，只對少數藥物敏感，對青霉素的耐藥率為97.0%，幾乎完全耐藥。對替考拉寧、利奈唑胺、奎普奴丁/達福普利、替加環素和萬古霉素高度敏感，敏感率均為100.0%。試驗結果表明，糖肽類抗菌藥物對金黃色葡萄球菌感染效果最好，這也就出現了近些年臨床上金黃色葡萄球菌感染常規使用萬古霉素，有文獻報道已經出現了MRSA及VISA[2-3]。

金黃色葡萄球菌mecA基因編碼一種特殊的青霉素結合蛋白PBP2a(或PBP2′)，此蛋白極大地降低了與β-內酰胺類抗菌藥物的親和力從而產生耐藥性，CLSI指出在金黃色葡萄球菌菌體中檢測到mecA基因或者PBP2α蛋白即可判定為MRSA[7]。本研究中有73株菌株判定為MRSA，檢出陽性率為54.1%，與近年CHINET細菌耐藥監測網報道MRSA平均檢出率相當[8]。mecA基因陽性率為54.1%，苯唑西林耐藥率為54.8%，耐藥表型與耐藥基因略有差異，推斷是可能存在其他耐藥機制，比如可能是獲得性PBP2α以外的其他PBPs的修飾，由質粒介導后產生水解青霉素類藥物的β-內酰胺酶[9]，或者苯唑西林臨界耐藥金黃色葡萄球菌(BORSA)高產β-內酰胺酶等。TEM基因是另外一個β-內酰胺酶基因，總陽性率為32.6%。

有研究報道，MSSA相對MRSA毒力基因攜帶率更高，提示關注MRSA的同時，不能輕視MSSA感染[10]。本研究中MRSA和MSSA氨基糖苷類相關耐藥基因主要為ant6和aac6′/aph2′，文獻報道的MRSA主要攜帶aac6′/aph2′基因[10]，MSSA主要攜帶ant6基因[11]。MRSA菌株慶大霉素耐藥率為93.2%,aac6′/aph2′基因的陽性率為62.2%，耐藥基因陽性率低于耐藥表型，不排除可能存在其他耐藥相關基因或者其他耐藥機制，比如aph(3)-Ⅲ基因、ant4′基因等[12]。一般認為，90%以上對氨基糖苷類耐藥的葡萄球菌至少包含一個編碼氨基糖苷類抗菌藥物修飾酶的基因[13]。MSSA慶大霉素耐藥率(40.3%)高于ant6基因的陽性率(17.0%)，同樣也不排除可能存在其他耐藥相關基因或者其他耐藥機制。

近年來，大量大環內酯類藥物在臨床中應用，導致紅霉素的耐藥性也在逐年提升。erm家族耐藥基因主要有ermA、ermB、ermC和ermF，其編碼的RNA甲基化酶對23S rRNA特定核苷酸殘基甲基化，erm基因上游的啟動子發生突變而使erm基因持續、穩定地表達導致大環內酯類藥物耐藥。文獻顯示，葡萄球菌主要以ermA和ermC基因為主[14]。在本研究中，ermA、ermB和ermC基因陽性檢出率分別為61.9%、28.1%和62.2%。MRSA耐藥基因以ermA和ermC基因為主，與JONES等[15]的報道一致，該結果較紅霉素耐藥率(78.1%)低，也就是說部分菌株同時存在2種或者2種以上耐藥基因，或者還有其他耐藥相關基因，比如文獻報道的msrA基因[16]和mphC基因[17]等；MSSA以ermC為主，耐藥基因陽性率高于紅霉素耐藥率，也就是說ermC基因可能不止與紅霉素耐藥相關，可能同時在其他非紅霉素的大環內酯類藥物導致的耐藥中也存在。

綜上所述，燒傷科患者感染金黃色葡萄球菌對多數抗菌藥物耐藥率較高，耐藥基因以mecA、ermA、ermC和aac6′/aph2′為主，MRSA耐藥基因陽性率一般高于MSSA，MRSA防控形勢不容樂觀。對于感染金黃色葡萄球菌的燒傷患者，臨床醫生應及時處理燒傷創面，并結合降鈣素原(PCT)和白細胞介素6(IL-6)水平監測患者預后，一般PCT和IL-6同時升高是預后不良的危險因子[18]，及時挑選合理、有效的抗菌藥物并控制藥量，減少抗菌藥物的濫用，治療MRSA感染并且預防高耐藥、高毒力的MRSA交叉傳播，盡早在休克平穩或其他并發癥基本控制后行植皮術，有效減少燒傷患者感染和創面愈合不良。從醫院內感染的角度，燒傷患者分離的金黃色葡萄球菌中mecA基因檢出率較高，提示其對季胺類消毒劑消毒皮膚效果可能欠佳[11]，醫院感染控制部門應加強細菌的耐藥性監測，有效控制多重耐藥菌的感染[19]。