三種常見CD36基因突變體標準質粒的構建*

陳尚良，劉正婷，黃佳麗，何海洪，黎紹昌，李立浩

南方醫科大學深圳醫院，廣東深圳 518000

高分辨率熔解曲線分析方法因具有操作簡便、速度快、通量大、成本低、不受檢測位點局限，既可以檢測已知突變又可發現未知突變等優點，已經在多個領域中得到了廣泛的應用。本研究擬建立高分辨率熔解曲線分析方法，對常見的CD36基因突變進行篩查。然而，無論使用何種方法，通常需要已確認的DNA樣品對建立的方法進行評價和質量控制，但由于DNA樣品本身的限制性，其作為大規模篩查的標準品有其自身不足之處，因此需要克隆相應的質粒作為標準品。本研究首先利用重疊延伸PCR定點突變的方法獲取CD36基因突變片段，然后通過TA克隆技術分別構建含有CD36基因A1237C、C268T、329-330delAC突變片段的野生型和純合突變型質粒，為后續建立高分辨率熔解曲線分析(HRM)方法篩查CD36基因多態性奠定物質基礎。

1 材料與方法

1.1材料 DNA提取酚試劑(北京索萊寶公司，貨號：T0250)、核酸抽提試劑(24∶1北京索萊寶公司，貨號：P1014)、3M乙酸鈉(北京索萊寶公司，貨號：A1070)、X-gal (北京索萊寶公司，貨號：X1010)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(北京索萊寶公司，貨號：I8070)、DNA Marker(北京索萊寶公司，貨號：M1100)均購自廣州昂飛生物公司、克隆菌E.coli DH5α 感受態細胞 (Taraka，貨號：9057)、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara，貨號：R010A)、Takara Ex Taq?DNA Polymerase(Takara，貨號：RR001Q)、pMD19-T Vector Cloning Kit(Takara,貨號：6013)均購自廣州瑞真公司，質粒小提試劑盒(Magen，貨號：D2110-02)均購自廣州美基生物公司。

1.2方法

1.2.1人血基因組DNA提取 健康人乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝外周全血來源于南方醫科大學深圳醫院輸血科。取1 mL全血樣本，采用酚氯仿法提取外周血基因組DNA，具體方法詳見產品說明書。最后用30 μL TE緩沖液溶解血基因組DNA，置于-20 ℃凍存備用。

1.2.2PCR引物設計 基于重疊延伸PCR定點突變的原理，使用Primer3 Plus引物設計網站設計針對CD36基因A1237C、C268T、329-330delAC突變的引物，每個突變位點共4條引物，見表1。F和R分別代表側翼上游和下游引物，用于擴增含突變位點的全長片段。Fm和Rm為引入突變位點的突變上游和下游引物，并且部分序列重疊互補，與側翼引物配對擴增含有突變位點的上、下游序列。

表1 引物序列

注：下劃線表示堿基替換或缺失位點。

1.2.3重疊延伸PCR定點突變方法原理 重疊延伸PCR定點突變是通過2輪PCR擴增來完成的。第1輪PCR以經過雙向測序驗證為CD36基因野生型的健康人血基因組DNA為模板，以側翼上游和突變下游為引物，在高保真酶的作用下進行PCR擴增獲得含有突變位點的上游序列。同時，以經過雙向測序驗證為CD36基因野生型的健康人血基因組DNA為模板，以側翼下游和突變上游為引物，在高保真酶作用下進行PCR擴增，獲得含有突變位點的下游序列。這兩個反應同時進行，最后獲得含有重疊片段的PCR產物，將其經過切膠回收純化后，等濃度、等量混合。第2輪PCR擴增以上述混合PCR產物為模板，以側翼上游引物和側翼下游引物為模板，在Taq酶作用下進行PCR擴增，獲得含有突變位點的全長片段。同樣以健康人血基因組DNA為模板，側翼上游引物和側翼下游引物為引物，在Taq酶作用下進行PCR擴增，獲取野生型片段。

1.2.4PCR擴增

1.2.4.1第1輪PCR擴增 以經過雙向測序驗證為CD36基因野生型的健康人血基因組DNA為模板，引物F與Rm、Fm與R搭配，在高保真酶的作用下進行PCR擴增。反應體系為50 μL：0.5 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μL)，4 μL dNTP mixture(2.5 mmol/L each)，10 μL 5 × PrimeSTAR buffer(Mg2+Plus)，1 μL引物(5 pmol)，200 ng模板，加滅菌雙蒸水至50 μL。PCR擴增條件：98 ℃變性10 s， 55 ℃退火5 s,72 ℃延伸10 min，共40個循環。最后置于4 ℃保存30 min。

1.2.4.2第2輪PCR擴增 將第1輪PCR產物進行切膠，回收純化，具體按照試劑盒說明書操作。將純化后的PCR產物按照相同濃度混合作為第2輪PCR擴增的模板，F與R為引物，在Taq酶作用下進行第2輪PCR擴增。反應體系為50 μL：0.25 μL Takara Ex Taq?DNA Polymerase(5 U/μL)，4 μL dNTP mixture(2.5 mmol/L each)，1 μL引物(0.2 μmol/L)，200 ng模板，加滅菌雙蒸水至50 μL。PCR擴增條件：98 ℃變性10 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環。最后置于4 ℃保存30 min。

1.2.5TA克隆 將第2輪PCR產物用DNA純化試劑盒切膠回收純化，純化后的PCR產物作為TA克隆的模板，將目的基因片段與pMD19-T Vector連接，連接反應體系為5 μL，包括1 μL pMD19-T Vector，0.1～0.3 pmol的PCR產物，加滅菌雙蒸水補足至5 μL。具體操作詳見說明書。最后將反應產物導入E.coli DH5α 感受態細胞，然后涂布于含有X-gal、異丙基硫代半乳糖苷(IPIG)、氨芐青霉素(Amp)的平板中37 ℃過夜培養。

1.2.6質粒提取 挑取單個白色菌落于5 mL含有氨芐青霉素的LB液體培養基中37 ℃振蕩培養12 h，取2 mL菌液用于質粒提取采用質粒抽提試劑盒進行質粒提取，具體操作詳見說明書。剩下的菌液用15%甘油保種。

1.2.7DNA測序 將菌液和重組質粒送上海生工生物有限公司廣州分公司進行序列測定，以驗證是否成功克隆。結果用SeqMan軟件及NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行BLAST 分析。

2 結 果

2.1第1輪PCR擴增產物電泳結果 1.5%瓊脂糖電泳結果顯示：泳道1、4、7分別是3種突變的CD36基因野生型片段，PCR產物條帶大小分別為372、253、489 bp；泳道2和3分別是含有A1237C突變的上游序列和下游序列，PCR產物條帶大小分別為233、156 bp；泳道5和6分別是含有C268T突變的上游序列和下游序列，PCR產物條帶大小分別為115、112 bp；泳道8和9分別是含有329-330delAC突變的上游序列和下游序列，PCR產物條帶大小分別為235、267 bp。見圖1。

2.2第2輪PCR產物電泳結果 1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示：含有CD36基因A1237C突變的全長片段大小是372 bp，含有CD36基因C268T突變的全長片段大小是253 bp；含有CD36基因329-330delAC突變的全長片段大小是487 bp。見圖2。

2.3重組質粒的DNA測序結果 將菌液和重組質粒進行DNA測序鑒定，并且在NCBI網站上使用BLAST進行序列比對。測序結果顯示，重組質粒pMD19-1237CD36基因1237處的堿基由A突變為C，其余序列和野生型序列相同；重組質粒pMD19-268268處堿基由C突變為T，其余序列同野生型；重組質粒pMD19-329-330的329-330處缺失兩個堿基A和C。由此可見，成功構建了上述3個常見CD36基因突變的質粒。

注：M為DNA marker；泳道1、4、7為CD36基因野生型PCR產物；泳道2、5、8為含有A1237C、C268T、329-330delAC上游序列PCR產物；泳道3、6、9為含有A1237C、C268T、329-330delAC下游序列PCR產物。

圖1 第1輪PCR產物以及野生型PCR產物電泳圖

注：M為DNA marker；泳道1～4為A1237C突變基因片段PCR產物；泳道5～8為C268T突變基因片段PCR產物；泳道9～10為329-330delAC突變片段PCR產物。

圖2 第2輪PCR產物電泳圖

3 討 論

CD36亦稱血小板膜糖蛋白Ⅳ(GPⅣ)或NaKa抗原，是一種相對分子質量約為88 000的糖基化蛋白，屬于B類清道夫受體家族，其廣泛分布于血小板、單核細胞、巨噬細胞、紅細胞前體細胞及毛細血管內皮細胞等多種細胞表面[1]。CD36缺失分為兩種類型：Ⅰ型缺失是血小板和單核細胞均缺乏CD36抗原，而Ⅱ型缺失僅是血小板缺乏CD36抗原。通常僅Ⅰ型缺失即可導致同種免疫性血小板減少癥的發生。有研究報道，Ⅰ型CD36缺失的發生是由CD36基因雜合突變或者純合突變所致，最常見的突變是C268T、949insA及329-330delAC[2]。CD36基因多態性在不同國家和地區，不同人群之間存在明顯差異，亞洲人群CD36基因突變主要是C268T，占所有突變的50%以上[3]，國內學者報道中國CD36基因突變主要是329-330delAC[4]。

隨著分子診斷技術的不斷發展，現階段篩查CD36基因多態性的方法主要有實時PCR、直接測序法、聚合酶鏈反應-限制性酶長度多態性分析(PCR-RFLP)、序列特異引物引導的聚合酶鏈式反應(PCR-SSP)[5-7]等，但是上述方法均存在操作煩瑣、耗時長、容易產生PCR產物污染等缺點，不適于臨床大規模應用。HRM方法是最近興起的用于基因突變掃描和基因分型的分子診斷技術，由于該方法具有成本低、靈敏度高、PCR污染小等優點，被廣泛應用于珠蛋白生成障礙性貧血基因突變的篩查[8]、結核分枝桿菌耐藥基因篩查[9]、腫瘤基因突變及甲基化篩查[10]等。

基于HRM方法的特性，本研究擬建立一種HRM技術檢測CD36基因多態性的方法。在建立該方法的過程中，需要提供已確認的DNA樣品對方法進行評價，以及質量控制等，然而，由于DNA樣品本身的特性，其作為大規模篩查的標準品存在一定的局限性，因此需要克隆相應的質粒作為標準品。本研究采用重疊延伸PCR突變方法人為地進行堿基的改變，獲取目的突變基因片段，再通過TA克隆技術構建含有目的片段的野生型和純合突變型質粒，為HRM方法篩查CD36基因多態性提供基因型標準品。

目前用于PCR定點突變的技術有很多，甚至有些公司研發了相關的商品化試劑盒，例如Takara公司的多點突變試劑盒、天根公司的快速定點突變試劑盒等，然而這些試劑盒成本較高，不宜作為實驗室首選的定點突變方法。重疊延伸PCR技術是一種高效、經濟的突變方法，該方法可對DNA片段中間區域的堿基進行人為的突變，包括堿基的插入、缺失、替換等。基于重疊延伸PCR方法的原理，本研究設計了針對CD36基因A1237C、C268T、329-330delAC突變的引物，包括用于擴增全長的側翼引物，并且對引物引入了突變位點，用于擴增包含突變位點及其上、下游序列，通過2輪PCR和3個反應來獲得突變片段。為了防止PCR擴增過程中發生堿基錯配，在第1輪PCR擴增采用了高保真酶，該酶擴增效率高，還具有3′-5′核酸外切酶的活性，可以在PCR擴增過程中切除錯配的堿基，從而提高PCR擴增的保真性。而第2輪PCR則使用Taq酶進行擴增，在擴增結束后可在PCR產物末端加A，反應產物可以直接和T載體連接，進行TA克隆。為了驗證質粒是否構建成功，本研究還對重組質粒進行DNA測序分析驗證，測序結果表明，成功將CD36基因1237位點處堿基由A突變成C，268位點處堿基由C突變成T，329位點處缺失A、C兩個堿基。

綜上所述，本研究成功構建了3種常見CD36基因突變體標準質粒，為后續建立HRM技術檢測CD36基因多態性提供了基因分型對照。