環(huán)介導等溫擴增技術便捷檢測淋病奈瑟菌porA基因

向 波，向 輝，易 平，劉龍亞，印道春，田 芳，符自清△

吉首大學第一附屬醫(yī)院/湘西州人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.腫瘤科；3.泌尿外一科；4.皮膚科，湖南吉首 416000

淋病是由淋病奈瑟菌(NG)引起的性傳播性疾病。NG是國家法定監(jiān)控的細菌之一，盡管淋病發(fā)病率高，但全國NG檢出率低[1-3]。目前，臨床醫(yī)生診斷淋病的重要依據是泌尿生殖系統(tǒng)的流膿癥狀,以及涂片發(fā)現(xiàn)革蘭陰性雙球菌。該方法診斷男性淋病患者具有一定準確性，但不適用于診斷淋病性宮頸炎和淋病性盆腔炎的女性患者。盡管各大醫(yī)院普遍開展了NG分子生物學檢測技術，然而國內女性淋病患者的陽性檢出率一直處于較低水平[3-4]。這是由于女性患者感染癥狀不明顯，以及臨床醫(yī)師和檢驗技師的一系列錯誤認識和不當操作共同導致。因此，臨床迫切需要研發(fā)一種更高效的檢測系統(tǒng)，用于提高女性淋病患者陽性檢出率。環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術是2000年開發(fā)出來的一種比傳統(tǒng)分子生物學檢測技術更簡便快捷，且特異度更高的新型分子生物學檢測技術[5-7]。LAMP技術采用Bst-DNA聚合酶，針對模板DNA的6個靶區(qū)巧妙設計1對內部復合引物和1對外圍引物，通過60 ℃恒溫水浴30～60 min，可獲得超過10億拷貝的擴增產物[8-10]。本課題組設計了一套新的針對NG菌株porA基因保守序列的LAMP檢測系統(tǒng)，并分析其與國內主流淋球菌PCR檢測技術的差異。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年1月至2019年1月本院32例淋病性宮頸炎和88例非淋病性宮頸炎患者的宮頸膿性分泌物拭子。排除院前使用抗菌藥物治療病例,所有患者獲得NG細菌培養(yǎng)證據。本研究獲得本院倫理委員會批準。

1.2LAMP反應體系設計 從Genebank獲取NG porA基因堿基序列。在線設計1對內部復合引物FIP、BIP(FIP是F2與F1c的復合引物，BIP是B2與B1c復合引物)和1對外圍引物F3、B3(https://primerexplorer.jp/)。DNA模板2.0 μL，Bst DNA聚合酶1.0 μL，引物Mix 2.5 μL，反應Mix 12.0 μL，雙蒸水2.5 μL，反應體系20.0 μL，保持60 ℃水浴50 min，85 ℃維持2 min。每管加入1.0 μL 顯色劑SYTO-9，綠色判為陽性。

1.3儀器與試劑 LAMP反應引物由生工生物(上海)股份有限公司合成，采用凱杰公司試劑提取上述標本DNA后，使用60 ℃水浴箱進行LAMP檢測。PCR儀器為美國ABI7500 PCR儀。

1.4統(tǒng)計學處理 將120例LAMP數(shù)據與120例PCR數(shù)據進行配對設計，比較兩種方法陽性檢出率差異，采用McNemar檢驗計算確切概率。將32例淋病數(shù)據和88例非淋病性宮頸炎患者數(shù)據分層。淋病組數(shù)據配對后，比較靈敏度差異；非淋病組數(shù)據配對后，比較特異度差異，采用Fisher確切概率法。應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1引物及相關參數(shù) 各引物5′端自由能(5′dG)和3′端自由能(3′dG)均小于-4.00，Tm均為60 ℃左右。見表1。

表1 LAMP系列引物的相關參數(shù)

注：-表示此項無數(shù)據。

2.2LAMP技術和PCR技術檢測性能分析 120例淋病性和非淋病性宮頸炎標本的LAMP和PCR技術檢測結果配對數(shù)據，通過McNemar確切概率檢驗，兩種方法陽性檢出率分別為25.83%、20.83%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。LAMP和PCR的靈敏度分別為96.88%、78.13%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；二者特異度均為100.00%。見表2。

表2 LAMP技術和PCR技術檢測性能分析

3 討 論

NG具有較強的抗菌藥物耐藥潛力[11-13]。20世紀80年代，中國淋球菌耐藥監(jiān)測系統(tǒng)應運而生[2-3]。從理論上分析，男性與女性患病率應接近1∶1。然而，近30余年來，女性淋病患者的陽性檢出率一直遠遠低于男性[3]。造成女性患者大量漏診的因素較復雜，涉及以下6個方面：(1)女性患者常常是隱性感染，檢出率低；(2)女性生殖道微生態(tài)復雜度高，降低了PCR靈敏度；(3)錯誤將陰道后穹窿分泌物等同于宮頸分泌物送檢進行NG PCR檢測；(4)抗菌藥物導致細菌培養(yǎng)假陰性；(5)多數(shù)基層實驗室無二氧化碳培養(yǎng)箱等硬件設備；(6)檢驗技師未掌握NG培養(yǎng)方法。

因此，亟需建立一種廉價、技術門檻低、靈敏度和特異度高的檢測方法，以有效降低女性淋病患者漏診率。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，LAMP技術是一種極其適用于NG檢測的分子生物學新技術，具有3點明顯優(yōu)勢[14]：(1)檢測溫度恒定在60 ℃左右，基因擴增結果可視化。不需要昂貴PCR儀器，試劑不涉及熒光探針，成本低。這適合大多數(shù)醫(yī)院常規(guī)開展淋病篩查。(2)LAMP技術繞開了主流實時熒光定量PCR技術包含的溫度梯度循環(huán)程序，避免了溫度梯度循環(huán)的時間損耗，直接降低檢測時間至1 h之內。(3)檢測系統(tǒng)需要兩套引物，檢測的特異度較PCR高。但是LAMP技術較傳統(tǒng)PCR技術更復雜，引物設計較難，這是限制其應用的主要因素之一。

本項研究的新穎之處在于，本課題組自主設計了一套新的針對NG細菌porA基因保守序列的LAMP檢測系統(tǒng)。LAMP技術的核心在于設計前向內引物和后向內引物的篩選，以及5′dG和3′dG小于-4.00，并避免引物間的二聚體。本套引物自由能最大值為-4.62，最小值為-6.42，利于引物5′端的特異性結合，利于3′端正確引發(fā)。本研究運用Oligo6.0分析并修正了個別堿基，控制了4個引物間二聚體的發(fā)生率。通過上述工作，從理論上保證了引物特異性。

為進一步驗證本課題組設計的LAMP方法的檢出率，收集了NG細菌培養(yǎng)陽性的32例淋病性宮頸炎和88例非淋病性宮頸炎患者的宮頸膿性分泌物拭子，同時進行LAMP檢測和PCR檢測，以比較兩種檢測技術的差異。NG PCR檢測及細菌培養(yǎng)過程耗時長，價格高，不適合門診患者及時診治，患者接受程度低。傳統(tǒng)PCR技術在擴增效率為100%的前提下，擴增產物呈現(xiàn)2n倍增長，27個循環(huán)后，可以達到1億個拷貝數(shù)。然而，LAMP檢測技術的循環(huán)擴增階段比PCR循環(huán)復雜，產物遠超2n倍增長[15]。故LAMP技術在方法學上擁有更高的靈敏度。本研究經檢測120例細菌性宮頸炎患者宮頸分泌物標本，結果發(fā)現(xiàn)LAMP技術靈敏度比NG PCR技術高，為96.88%，檢測時間由2 h縮短至50 min以內。本課題所設計的NG LAMP系統(tǒng)只需要60 ℃水浴30～50 min就可以依據顯色劑SYTO-9的顏色變化判斷陰陽性，是一種較理想的淋病分子生物學篩查技術。本課題的不足之處在于驗證的樣本量尚不夠多，應在更大的人群中進一步驗證該方法的檢測效能。

總之，正確推廣LAMP技術可大幅提升女性淋病患者的陽性檢出率，降低漏診率。