耐碳青霉烯酶腸桿菌科細菌血流感染的基因分析

陳建平，朱 菁，黃 旭，梅亞寧

1.江蘇省南京市六合區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，江蘇南京 211500；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗科，江蘇南京 210029;3.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院/江蘇省人民醫(yī)院檢驗學(xué)部，江蘇南京 210029

在我國，腸桿菌科細菌感染不斷增加，已成為醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌，其導(dǎo)致的血流感染也逐年增加。引起血流感染的腸桿菌科細菌有大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌等，其中以大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌感染最常見[1-2]。這類菌株易出現(xiàn)耐藥菌株，尤其是耐碳青霉烯酶的菌株，其導(dǎo)致的血流感染嚴(yán)重且預(yù)后較差[3]。本文收集2016年1-12月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院患者血流感染中分離無重復(fù)的亞胺培南和(或)美羅培南耐藥的菌株，并對其進行碳青霉烯酶的檢測，了解這些菌株相關(guān)耐藥基因攜帶和藥物敏感性，為臨床治療提供依據(jù)。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 采用WHONET5.6軟件，收集2016年1-12月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院患者血流感染共分離到的16株耐碳青霉烯酶菌。其中4株為大腸埃希菌，12株為肺炎克雷伯菌。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706。收集研究菌株對應(yīng)患者的基本資料，包括年齡、科室、臨床診斷、抗菌藥物使用時間、入院到分離耐碳青霉烯酶腸桿菌科細菌(CRE)時間、侵入性操作、治療藥物、轉(zhuǎn)歸。研究菌株編號1-16，分別對應(yīng)菌株保存編號X020E6、X008C6﹑X011A9﹑X008F5﹑X016D4、X009J5、X009H5、X010F7、X015C8、X010E2、X010F1、X009A5、X015B9、X021C4、X021E4、X017G1。

1.2儀器與試劑 美羅培南、亞胺培南、氨曲南等為中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品，替加環(huán)素E-test條、藥敏紙片、MH瓊脂、MH肉湯為英國Oxoid公司產(chǎn)品，GNI細菌檢定卡和VITEK2-Compact全自動微生物鑒定儀為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，PCR檢測試劑盒和DNA Marker為武漢谷歌生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1CRE初篩 用Vitek2-Compact全自動細菌鑒定儀對血流感染中的CRE進行初篩。

1.3.2改良Hodge試驗 參照2016年美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)M100-S26文件中腸桿菌科菌產(chǎn)碳青霉烯酶的改良Hodge試驗進行[4]。

1.3.3耐藥酶基因檢測 耐藥酶基因檢測采用PCR法，引物序列和擴增產(chǎn)物長度見表1。實驗方法參考文獻[5]。

1.3.4微量肉湯稀釋法 用微量肉湯稀釋法檢測16株菌株對美羅培南、亞胺培南、多黏菌素、替加環(huán)素、氨曲南的敏感性，判讀及結(jié)果解釋參照2016年美國CLSI M100-S26文件進行。替加環(huán)素采用美國食品藥品管理局(FDA)推薦的解釋標(biāo)準(zhǔn)進行判讀，最低抑菌濃度(MIC)≤2.0 mg/L為敏感，4.0 mg/L為中介，MIC≥8.0 mg/L為耐藥。

2 結(jié) 果

2.1患者高危因素 16株研究菌株患者年齡大于60歲的占 87.50%(14/16),重癥監(jiān)護病房(ICU)患者占43.75%(7/16)，長期使用抗菌藥物患者占68.75%(11/16)，長期住院患者占56.25%(9/16),有侵入性操作治療患者占68.75%(11/16)。見表2。

表1 引物序列和產(chǎn)物

2.2改良Hodge試驗結(jié)果 16株菌株進行改良Hodge試驗，12株肺炎克雷伯菌改良Hodge試驗陽性，4株大腸埃希菌中有2株改良Hodge試驗為陽性，2株為陰性。

2.3耐藥基因檢測結(jié)果 耐藥基因的檢測結(jié)果見圖1。16株CRE菌株的耐藥基因均為肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC-2)基因。

注：M為DNA Marker;泳道1-16為目的基因。

圖1 KPC-2基因擴增產(chǎn)物電泳圖

注：-表示未使用抗菌藥物。

2.4微量肉湯稀釋法結(jié)果 用微量肉湯稀釋法檢測16株CRE對抗菌藥物的敏感性，結(jié)果顯示，16株菌株對美羅培南、亞胺培南、氨曲南耐藥，對多黏菌素，替加環(huán)素敏感。見表3。

表3 16株菌株抗菌藥物MIC值(mg/L)

3 討 論

腸桿菌科細菌是社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染中最常見的病原菌，可引起下呼吸道、消化道、泌尿道、血液、手術(shù)切口等多種部位感染。有研究報道，在院內(nèi)血流感染中前3位的病原菌依次為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌[6]。目前，KPC-2基因型酶在我國的浙江、上海、江蘇、湖南、北京、山東等多省市均有報道,其中長江三角洲地區(qū)報道最多[7]。本研究中，16株可疑產(chǎn)碳青霉烯類菌均含KPC-2基因，表明KPC-2是南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血流感染患者耐碳青霉烯酶腸桿菌科的主要基因型，與以往文獻報道相似[8]。醫(yī)務(wù)人員應(yīng)對CRE菌株的傳播與感染提高警惕，盡早采取措施監(jiān)測患者感染菌的耐藥情況，加強對此類患者的管理，減少其與其他患者接觸的機會，切斷感染途徑。

耐碳青霉烯酶腸桿菌科的臨床治療一直是個難題，CRE幾乎對所有β-內(nèi)酰胺抗菌藥物耐藥，同時攜帶有其他耐藥機制，對氨基糖苷、喹諾酮類也耐藥，對多黏菌素和替加環(huán)素具有較高的體外敏感性[7]，這與本研究中藥敏結(jié)果一致。我國廣泛耐藥革蘭陰性菌感染診治專家共識建議使用以多黏菌素和(或)替加環(huán)素為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥方案治療CRE細菌感染[9]。本研究中，有替加環(huán)素聯(lián)合亞胺培南治療，也有亞胺培南單獨治療，還有美羅培南聯(lián)合左氧氟沙星治療，臨床均顯示預(yù)后良好。

CRE引起的感染對患者威脅越來越大，目前缺乏確認(rèn)有效的治療藥物，所以醫(yī)院內(nèi)感染控制顯得尤為重要。有研究表明，CRE的易感因素有疾病危重、入住ICU、長期使用抗菌藥物、有侵入性操作等[7]。本研究中的CRE病例7株分布在ICU，概率為43.75%，其他病例也主要分布在外科，這與以往文獻報道一致[10]。面對CRE的威脅，醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)了解患者感染CRE的危險因素，采取相應(yīng)的干預(yù)措施，包括手衛(wèi)生、接觸隔離、醫(yī)務(wù)人員培訓(xùn)、最低限度使用侵入性操作、檢出CRE時實驗室及時通知醫(yī)護人員、促進抗菌藥物管理、保持環(huán)境衛(wèi)生等[11]。

CRE的血流感染給患者治療帶來了極大的困難，同時也給醫(yī)院內(nèi)感染防控提出了挑戰(zhàn)。CRE的處理要從整體、全局出發(fā)，注重抗菌藥物合理使用、病原菌檢測、耐藥菌監(jiān)測、患者管理等[12]。因此，加強CRE的監(jiān)測，嚴(yán)格執(zhí)行抗菌藥物合理使用的管理規(guī)定，同時加強醫(yī)院內(nèi)感染預(yù)防與控制，避

免CRE在院內(nèi)傳播和不斷演變。