肺炎克雷伯菌在某院醫(yī)院內(nèi)感染中的分布及耐藥性分析

肖啟國，湯美華

湖南省衡陽市中心醫(yī)院檢驗科，湖南衡陽 421001

肺炎克雷伯菌作為一種常見的病原體類型，廣泛分布于人體皮膚、鼻咽部、呼吸道、腸道及自然界的水土中[1]。肺炎克雷伯菌常定植于人體呼吸道與腸道，可通過侵入性操作侵犯傷口和泌尿道而引起感染，當人體免疫力降低時，可以引起較為嚴重的感染，甚至敗血癥[2-4]。近年來，由于各類廣譜抗菌藥物大量應用于臨床，同時激素、免疫抑制劑的使用也在不斷增多，特別是第三代頭孢菌素的廣泛使用，使細菌在藥物的選擇壓力下獲得多重耐藥性等，且隨著產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)菌株的出現(xiàn)，細菌耐藥性日趨嚴峻[5]。對于ESBLs腸桿菌科細菌感染的治療，目前臨床中主要是應用碳青霉烯類抗菌藥物，臨床療效顯著，但最近，腸桿菌科細菌產(chǎn)碳青霉烯酶(KPC)在國內(nèi)外的報道越來越多[6-7]。對于臨床分離的肺炎克雷伯菌，主要是產(chǎn)頭孢菌素酶(AmpC)、KPC及ESBLs。本研究對本院分離的多重耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥性進行分析，旨在對臨床合理用藥產(chǎn)生指導性意義，并對此種細菌在醫(yī)院內(nèi)的感染加以有效控制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 2015年1月至2016年12月來自臨床住院患者痰、咽拭子、尿液、血液等標本分離的286株肺炎克雷伯菌。

1.2儀器與試劑 TDR-300B微生物鑒定分析儀，比濁儀，ESBLs檢測試劑盒，MH瓊脂平板，OXOID藥敏紙片，游標卡尺，離心機，三洋低溫冰箱MDFU32V。

1.3方法

1.3.1藥敏試驗 采用紙片擴散法(K-B法)和最低抑菌濃度(MIC)試驗檢測肺炎克雷伯菌對阿米卡星(AK)、慶大霉素(CN)、氨芐西林(AMP)、氨芐西林/舒巴坦(SAM)、哌拉西林(PIP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、妥布霉素(TOB)、亞胺培南(IMP)、頭孢曲松(CRO)、頭孢唑啉(KZ)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢呋辛(CXM)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢西丁(FOX)、氨曲南(ATM)、復方磺胺甲噁唑(SXT)、洛美沙星(LOM)、環(huán)丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)等藥物的耐藥性。判定標準依據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)(2014年版)的規(guī)定。

1.3.2ESBLs表型篩選與確證試驗 篩選出藥敏試驗中抑菌環(huán)直徑CAZ≤22 mm或CTX≤27 mm或CRO≤25 mm或ATM≤27 mm的菌株為疑產(chǎn)ESBLs株。對疑產(chǎn)ESBLs菌株再采用K-B法進行確證試驗,使用每片含30 μg CAZ、CTX紙片和頭孢他啶/克拉維酸(CAC，30 μg/10 μg)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTC，30 μg/10 μg)復合紙片進行試驗，當任何一種復合藥敏紙片抑菌圈直徑與其單獨藥敏紙片抑菌圈直徑之差≥5 mm,即可確認為產(chǎn) ESBLs株。

1.3.3KPC表型篩查試驗 采用K-B法，根據(jù)CLSI(2014年版)標準，美羅培南(MEM，10 μg)或IMP(10 μg)抑菌圈直徑≤22 mm為表型篩查陽性。

1.3.4產(chǎn)新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(NDM-1)表型確診試驗 雙紙片協(xié)同試驗采用IMP(10 μg)或MEM(10 μg)/乙二胺四乙酸(EDTA,1 500 μg)兩種紙片(K-B法)，兩紙片距離10～15 mm，在含EDTA紙片方向處，MEM或IMP抑菌圈直徑擴大，即可判定產(chǎn)NDM-1；組合紙片法采用IMP(10 μg)或MEM(10 μg)/EDTA復合紙片進行K-B法試驗，復合紙片比單藥紙片的抑菌圈直徑增大值為≥5 mm，即可判定產(chǎn)NDM-1。

1.3.5改良霍奇試驗 制備好0.5麥氏濁度的大腸埃希菌ATCC25922菌懸液，然后將菌懸液進行10倍稀釋，并使用棉簽將其均勻地涂布于MH平板中，然后在平板中央貼含10 μg MEM的紙片。使用接種環(huán)挑取受試菌自紙片邊緣向平板邊緣劃線接種。35 ℃孵育過夜，如果矢狀生長存在于MEM抑菌圈與待測菌株接種線交界處，則說明產(chǎn)KPC呈陽性。

1.3.6AmpC表型篩選及確認 采用FOX紙片使用瓊脂擴散法檢測臨床分離菌株。當抑菌圈直徑≤18 mm時,說明對FOX產(chǎn)生耐藥或中介，可能為產(chǎn)AmpC菌株,提示AmpC表型篩選呈現(xiàn)陽性。AmpC的確認試驗：FOX三維確認試驗是檢測AmpC的經(jīng)典方法，在涂布了0.5麥氏濁度大腸埃希菌標準菌株的平板上貼FOX紙片，向離心方向使用無菌刀片切一裂隙，距紙片邊緣5 mm處，將30～40 μL的待檢菌株β-內(nèi)酰胺酶初提液(過濾或低溫超速離心除去活菌)加入裂縫中，并防止酶初提液溢出裂隙，進行過夜培養(yǎng)，溫度在35 ℃，如果細菌生長于抑菌圈內(nèi)裂隙旁，則說明產(chǎn)AmpC陽性。采取反復凍融法進行粗酶提取。

1.3.7質(zhì)控菌株 質(zhì)控菌株包括大腸埃希菌 ATCC25922及肺炎克雷伯菌 ATCC700603。

1.4統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計應用WHONET5.4軟件，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs的耐藥率比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1標本分布 286株肺炎克雷伯菌主要分離自痰(228株，79.72%)、尿液(25株，8.74%)、傷口分泌物(16株，5.59%)。見表1。

2.2科室分布 286株肺炎克雷伯菌主要分布在ICU(56.29%)，呼吸內(nèi)科(27.62%)，見表2。

2.3藥敏試驗比較 分離的286株肺炎克雷伯菌中，產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌162株，檢出率為56.64%，其耐藥率遠遠高于非產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表1 肺炎克雷伯菌株標本類型分布構(gòu)成比(%)

表2 肺炎克雷伯菌株在各科室分布構(gòu)成比(%)

表3 產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌株耐藥率(%)

續(xù)表3 產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌株耐藥率(%)

2.4耐藥表型分析 本研究286株肺炎克雷伯菌中產(chǎn)ESBLs菌株162株，檢出率為56.64%；產(chǎn)AmpC酶菌株39株，檢出率為13.64%；產(chǎn)KPC酶菌株28株，檢出率為9.79%；產(chǎn)NDM-1菌株2株，檢出率為0.70%。

3 討 論

作為引起呼吸道感染為主要醫(yī)院內(nèi)感染的一種常見致病菌，肺炎克雷伯菌多造成肺、創(chuàng)面、泌尿系統(tǒng)及血液等的感染，導致患者出現(xiàn)菌血癥、肺炎及尿路感染等。本研究對分離的286株來自臨床患者的肺炎克雷伯菌進行分析，分離自痰和咽拭子的標本占81.47%，且臨床分布主要在ICU和呼吸內(nèi)科，表明該菌主要引起呼吸道感染，與文獻報道較一致[8-9]。肺炎克雷伯菌由于受到抗菌藥物廣泛使用的影響，其耐藥菌株呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢。在本研究中，肺炎克雷伯菌的耐藥性主要體現(xiàn)在第二代頭孢菌素中，與此同時，對第三代頭孢菌素及第四代頭孢菌素的耐藥性也在持續(xù)增加，但是對碳青霉烯類抗菌藥物(如IMP和MEM)的耐藥率相對較低，但有逐年增高的趨勢[10-11]。本研究檢出產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌28株，檢出率9.79%，應引起臨床醫(yī)生的重視，而造成此結(jié)果的主要原因可能是受到第三代頭孢菌素和IMP/西司他丁鈉應用于呼吸內(nèi)科及ICU的影響，此次標本結(jié)果中共有產(chǎn)NDM-1的肺炎克雷伯菌患者2例，為防止該基因的擴散流行，臨床及感控部門應引起重視。

由于第三代頭孢菌素在臨床中廣泛使用，產(chǎn)ESBLs及高產(chǎn)AmpC的革蘭陰性桿菌在持續(xù)增加,而且臨床中廣泛應用碳青霉烯類藥物(如IMP),因此造成產(chǎn)KPC的肺炎克雷伯菌及大腸埃希菌的不斷出現(xiàn)，同時產(chǎn)NDM-1的肺炎克雷伯菌也被檢出，多重耐藥和泛耐藥的革蘭陰性桿菌在臨床不斷被檢出，并且面臨著世界性流行，成為嚴重的社會問題，引起國內(nèi)外衛(wèi)生組織的廣泛關(guān)注。

將產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的耐藥性作為本次研究的重要分析內(nèi)容，在耐藥性方面，產(chǎn)ESBLs明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株。作為肺炎克雷伯菌的多重耐藥機制，產(chǎn)ESBLs的菌株能夠?qū)V譜青霉素和第一、二、三代頭孢菌素產(chǎn)生分解作用，與此同時甚至能夠水解第四代頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，其對氨基糖苷類及喹諾酮類抗菌藥物的耐藥性也相對較高。本研究結(jié)果顯示，產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌菌株中對含酶抑制劑的復合抗菌藥物SAM耐藥率高達95.06%，說明SAM已經(jīng)不適應于臨床對產(chǎn)ESBLs菌株引起感染的治療，TZP耐藥率相對較低，但也有20.99%。本研究中，產(chǎn)AmpC檢出率為13.64%(39株)，其中12株同時產(chǎn)ESBLs和AmpC菌株直接影響了復合抗菌藥物(含酶抑制劑)對產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的臨床治療效果，但是產(chǎn)ESBLs菌株對IMP等碳青霉烯類抗菌藥物具有較高的敏感性，臨床上仍可直接用于治療產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌引起的重度感染。

本研究結(jié)果顯示，產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌檢出率為56.64%，與國內(nèi)報道的結(jié)果相近[12]，表明本院也普遍存在較為嚴重的ESBLs菌株流行，其耐藥機制主要包括：抗菌藥物滲透障礙、改變抗菌藥物作用靶點、產(chǎn)生抗菌藥物主動外排機制、產(chǎn)生抗菌藥物滅活酶并在菌種間經(jīng)多種途徑進行耐藥基因的傳播。抗菌藥物在醫(yī)院、社區(qū)濫用是產(chǎn)生ESBLs耐藥菌株的重要原因，為降低產(chǎn)ESBLs菌株的發(fā)生率，應加強控制抗菌藥物的使用，抑制耐藥菌株的流行，建立細菌耐藥檢測體系，及時開展快速檢測產(chǎn)ESBLs、NDM-1、AmpC及KPC，確保為抗菌藥物在臨床中的合理使用提供更直接、更有效的證據(jù)，以指導臨床合理用藥，控制多重耐藥菌株的產(chǎn)生與傳播，防止耐藥株產(chǎn)生，引發(fā)醫(yī)院內(nèi)感染。