動(dòng)脈粥樣硬化生物學(xué)標(biāo)志物生物信息學(xué)技術(shù)分析

邵光耀　楊軍

[摘要] 目的 對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化（AS）病人基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，尋找AS發(fā)生發(fā)展相關(guān)的潛在基因。

方法 下載GEO數(shù)據(jù)庫中高通量基因芯片數(shù)據(jù)集GSE43292和GSE28829，行GO基因功能注釋和通路分析，然后進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析并可視化。

結(jié)果 經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，將差異表達(dá)基因在不同的生物學(xué)過程中富集，共篩選出了24個(gè)關(guān)鍵基因，文獻(xiàn)檢索顯示其中的MMP9、CXCR4、FABP4基因與AS相關(guān)。

結(jié)論 通過數(shù)據(jù)分析篩選出的24個(gè)差異表達(dá)基因，可為AS的分子診斷和治療開發(fā)提供算法預(yù)測(cè)和數(shù)據(jù)分析支持。

[關(guān)鍵詞] 動(dòng)脈粥樣硬化;生物標(biāo)記;計(jì)算生物學(xué);數(shù)據(jù)分析

[中圖分類號(hào)] R543.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2020）03-0347-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.123

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200610.2131.016.html;2020-06-11 17：05

A BIOINFORMATICS ANALYSIS OF BIOMARKERS FOR ATHEROSCLEROSIS

SHAO Guangyao， YANG Jun

（Department of Cardiology， Yantai Yuhuangding Hospital Affiliated To Qingdao University， Yantai 264000， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the potential genes associated with the development and progression of atherosclerosis （AS） by analyzing the gene chip data of patients with AS.

MethodsHigh-throughput gene chip datasets GSE43292 and GSE28829 were downloaded from the GEO database. The gene ontology function annotation and pathway analysis were performed， followed by protein-protein interaction network analysis and visualization.

ResultsAfter data analysis， the differentially expressed genes were enriched in different biological processes， and 24 key genes were screened out. Literature search showed that MMP9， CXCR4， and FABP4 were associated with AS.

ConclusionThe 24 differentially expressed genes screened out by data analysis can provide the support of algorithmic prediction and data analysis for the development of molecular diagnosis and treatment of AS.

[KEY WORDS]atherosclerosis; biomarkers; computational biology; data analysis

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是由于動(dòng)脈的變窄限制了富氧血液流向身體各個(gè)部位，從而引發(fā)AS相關(guān)臨床表現(xiàn)的疾病。AS與血管壁的炎癥過程、較高的低密度脂蛋白（LDL）水平具有相關(guān)性[1]，但導(dǎo)致該疾病的分子機(jī)制仍不清楚。AS的風(fēng)險(xiǎn)因素有很多，如膽固醇異常、高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖、家族史和不健康的飲食等。傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素，如高血壓、糖尿病等，在預(yù)測(cè)AS方面有一定作用[2]，但不能完全預(yù)測(cè)AS風(fēng)險(xiǎn)，因此尋找更敏感的生物標(biāo)志物，是當(dāng)前研究急需解決的問題。尋找生物標(biāo)志物有助于闡明疾病的分子機(jī)制，為疾病發(fā)生發(fā)展的預(yù)測(cè)提供更精確的證據(jù)。隨著基因測(cè)序及芯片技術(shù)的發(fā)展和成本不斷降低，生物信息學(xué)技術(shù)被廣泛用于分析疾病的基因組層面的變化，這些技術(shù)有助于識(shí)別芯片數(shù)據(jù)涉及的差異表達(dá)基因和功能通路。雖然不同廠商的芯片數(shù)據(jù)差異較大，但不同研究間還是可能具有共同的差異表達(dá)基因。因此，本研究下載并分析了來自美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）GEO數(shù)據(jù)庫的2個(gè)芯片數(shù)據(jù)集，以獲得AS組織和非AS組織的差異表達(dá)基因，尋找AS發(fā)生發(fā)展相關(guān)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

以“atherosclerosis”作為關(guān)鍵詞，在NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中檢索已公布的AS的基因芯片數(shù)據(jù)集，獲取分別于2013年4月和2011年4月發(fā)表的兩個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE43292和GSE28829。GSE43292數(shù)據(jù)集來源于里昂第一大學(xué)和北奧斯陸大學(xué)，采用Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array平臺(tái)，含有32個(gè)AS樣本和32個(gè)正常樣本的表達(dá)矩陣;該數(shù)據(jù)集選擇的是愛德華·赫里歐醫(yī)院的32例患有AS的病人，男女

比例為29∶5，平均年齡為（70±10）歲，患有慢性腎臟疾病、糖尿病、自身免疫性疾病和正在進(jìn)行類固醇或其他免疫抑制藥物治療的病人均被排除在外。GSE28829來源于馬斯特里赫特大學(xué)，采用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺(tái)，含有14個(gè)AS樣本和14個(gè)正常樣本的表達(dá)矩陣;該數(shù)據(jù)集選擇的是慕尼黑伊利諾伊州立醫(yī)院的尸體和血管外科手術(shù)切除的頸動(dòng)脈組織。

1.2 差異表達(dá)基因篩選及可視化

采用R語言的limma包進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析，差異表達(dá)基因的篩選條件為差異倍數(shù)log fold change>1.5、adjust<0.05;應(yīng)用R語言的plot數(shù)據(jù)包進(jìn)行畫圖與展示。

1.3 差異表達(dá)基因的功能富集分析

使用DAVID在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO基因功能分析[3]，并用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異表達(dá)基因的通路分析。以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)篩選基因并進(jìn)行可視化展示。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

本研究使用STRING數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org）（版本10.0）進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建差異表達(dá)基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，選擇綜合分?jǐn)?shù)大于0.4的主要蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，將得到的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件中進(jìn)一步分析。Cytoscape（3.4.0版）是一個(gè)開源生物信息學(xué)軟件平臺(tái)，用于可視化分子交互網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并使用MCODE模塊以MCODE scores>5、degree cut-off=2、node scorecut-off=0.2、Max depth=100、k-score=2為標(biāo)準(zhǔn)確定網(wǎng)絡(luò)中重要的區(qū)域，并進(jìn)行畫圖。

1.5 關(guān)鍵基因篩選

對(duì)上述網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行畫圖得到可能與AS相關(guān)的基因。為了驗(yàn)證所得到的基因是否與AS有關(guān)，通過檢索文獻(xiàn)獲得研究支持。

2 結(jié)果

2.1 原始數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化

進(jìn)行差異分析之前，為避免原始的基因矩陣中出現(xiàn)缺失值、基因?qū)?yīng)多個(gè)探針等情況，應(yīng)用R語言的limma包中normalize Between Arrays函數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化，隨后進(jìn)行可視化。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后兩個(gè)芯片數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)分布效果較好（圖1），可以進(jìn)行下一步差異分析。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)的聚類分析

使用R語言對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化的GSE43292、GSE28829數(shù)據(jù)集進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖（圖2）。結(jié)果表明，GSE43292、GSE28829數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了聚類的現(xiàn)象，提示在樣本中出現(xiàn)了某些基因的富集。

2.3 差異表達(dá)基因的篩選

GSE43292數(shù)據(jù)集經(jīng)篩選后得到1 086個(gè)基因，其中上調(diào)基因462個(gè)，下調(diào)基因624個(gè);GSE28829數(shù)據(jù)集經(jīng)篩選后得到1 733個(gè)基因，其中上調(diào)基因1 024個(gè)，下調(diào)基因709個(gè)。基因篩選后制作火山圖進(jìn)行可視化，見圖3。

2.4 差異表達(dá)基因的功能分析及通路分析

數(shù)據(jù)集GSE28829的富集分析表明，差異表達(dá)基因的細(xì)胞組分變化主要富集在細(xì)胞表面、血漿膜外側(cè)、細(xì)胞外體、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞基質(zhì)等，生物學(xué)過程主要富集在免疫球蛋白受體結(jié)合、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等。GSE43292的富集分析表明，差異表達(dá)基因的細(xì)胞組分變化主要富集于細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞基質(zhì)等，生物學(xué)過程主要富集在cAMP信號(hào)通路、細(xì)胞黏附通路、環(huán)狀體強(qiáng)化和色氨酸代謝通路等。見圖4。

2.5 差異表達(dá)基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

本研究得到可能導(dǎo)致AS的潛在關(guān)鍵基因共24個(gè)：MMP9、ACP5、SPP1、FABP4、CD84、ITGB2、CHI3L1、FCGR2B、KYNU、SLAMF8、CXCL2、CXCR4、CCL18、CCL19、PL2B、TNFSF13B、APOE、MS4A4A、TIMP1、SERPINA1、IGLL5、IGL5、IGJ、TFE3、IGLL5。進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)檢索結(jié)果顯示，MMP9、FABP4、CXCR4基因與AS相關(guān)。見圖5。

3 討論

AS的主要病因因素有很多，包括血液中較高水平的膽固醇和LDL、血液中低水平的高密度脂蛋白（HDL）、高血壓、煙草煙霧、糖尿病、肥胖、不健康的生活方式、家族心臟病史等。然而，該疾病的分子機(jī)制仍然沒有被闡明。隨著分子生物學(xué)發(fā)展和成本降低，基因分析、精準(zhǔn)治療成為新的診斷及治療手段。本研究使用R語言對(duì)GSE43292和GSE28829數(shù)據(jù)集進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖，結(jié)果表明，在這兩個(gè)數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)基因聚類的現(xiàn)象。通過功能富集及通路分析探索差異表達(dá)基因的功能注釋信息，并使用R語言繪制功能分析及通路分析的條形圖，結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因細(xì)胞組分主要集中在血漿膜外側(cè)、細(xì)胞基質(zhì)等，生物學(xué)過程主要富集在cAMP信號(hào)通路、細(xì)胞黏附通路等。再通過構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)篩選出了24個(gè)關(guān)鍵基因，經(jīng)文獻(xiàn)檢索顯示，其中的MMP9、FABP4、CXCR4基因與AS相關(guān)。

3.1 MMP9基因與AS相關(guān)性

纖維帽的細(xì)胞外基質(zhì)成分與冠狀動(dòng)脈AS斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)，其厚度與斑塊的穩(wěn)定性呈正相關(guān)。MMPs是一種蛋白酶系，其作用可加速纖維帽細(xì)胞外基質(zhì)分解，進(jìn)而導(dǎo)致斑塊破裂。MMPs可降解很多細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原、彈性蛋白、纖維連接蛋白等。MMP9是MMPs中的一種明膠酶，它可以分解粥樣斑塊和纖維帽中內(nèi)皮基底膜的Ⅳ型膠原，增加斑塊的不穩(wěn)定性，進(jìn)而引發(fā)斑塊的破裂[4]。本研究結(jié)果表明，MMP9基因與AS的不穩(wěn)定性相關(guān)。提示MMP9可能是AS的潛在生物標(biāo)志物。

已有實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證了MMP9和AS斑塊破裂的相關(guān)性[5]。有研究表明，高脂肪攝入的動(dòng)物相較于低脂肪攝入組具有更高水平的MMP9表達(dá)[6]。也有研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)一種治療高脂血癥的傳統(tǒng)中藥的作用靶基因可能為MMP9[7]。

3.2 FABP4基因與AS相關(guān)性

脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）是游離脂肪酸的伴侶蛋白，可與膽固醇、花生四烯酸可逆性結(jié)合。該蛋白主要表達(dá)在脂肪和巨噬細(xì)胞中，參與脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)及脂肪分解，促進(jìn)三酰甘油在脂肪細(xì)胞中的沉積，參與AS的病程。有研究顯示，F(xiàn)ABP4通過作用于脂蛋白酯酶，使血漿游離脂肪酸水平升高，而血漿游離脂肪酸水平升高又可以導(dǎo)致高三酰甘油血癥的形成，進(jìn)而參與斑塊進(jìn)展;在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞的過程中，F(xiàn)ABP4基因表達(dá)上調(diào)，加速了泡沫細(xì)胞中膽固醇和三酰甘油的積累，從而參與斑塊的進(jìn)展[8]。另有研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ABP4在代謝綜合征的冠心病病人中表達(dá)升高，并且其表達(dá)與冠狀動(dòng)脈AS程度和表皮脂肪組織體積有相關(guān)性[9]。也有研究顯示，F(xiàn)ABP4可以成為AS的獨(dú)立預(yù)測(cè)標(biāo)志物[10]。有回顧性分析研究顯示，血清FABP4水平與外周血管疾病的不良心血管事件具有相關(guān)性[11]。有成年小鼠的基因測(cè)序研究顯示，心臟內(nèi)皮細(xì)胞中FABP4的表達(dá)更高，F(xiàn)ABP4可能成為未來AS的重要靶基因標(biāo)志物[12]。

3.3 CXCR4基因與AS相關(guān)性

CXCR是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1的受體，參與內(nèi)皮損傷、修復(fù)過程。業(yè)已證實(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷誘發(fā)的細(xì)胞黏附、血小板聚集等過程，參與了AS過程的開啟。CXCR4可介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞向損傷區(qū)域的動(dòng)員，促進(jìn)損傷區(qū)域血管內(nèi)膜的增生，進(jìn)而參與內(nèi)膜的修復(fù)過程。有研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞中CXCR4的缺失，可降低細(xì)胞的增殖，進(jìn)而影響創(chuàng)面的愈合，加速巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致AS過程的進(jìn)展[13]。此外，有實(shí)驗(yàn)研究表明，小鼠CXCR4的敲除或抑制阻斷了CXCL12對(duì)TCF21和ABCA1表達(dá)的影響，以及GSK3β和β-catenin的磷酸化，而小鼠中過度表達(dá)CXCL12可擴(kuò)大AS病變區(qū)域，可能導(dǎo)致AS斑塊中巨噬細(xì)胞的滲透[14]。

有研究表明，使用新型CXCR4定向正電子發(fā)射斷層掃描示蹤劑，相較于傳統(tǒng)的正電子發(fā)射斷層掃描示蹤劑能夠檢測(cè)出更多的AS斑塊[15-16]。另有研究表明，CXCR4在B-1細(xì)胞中的表達(dá)與血漿中針對(duì)malondialdehyde-modified LDL的IgM抗體呈正相關(guān)，與冠狀動(dòng)脈斑塊的程度呈負(fù)相關(guān)[17]。有基因研究顯示，BPIFB4可能調(diào)節(jié)CXCR4，參與小鼠AS和炎癥進(jìn)展，這為未來的基因治療AS提供了可能[18]。有研究顯示，CXCL12與CXCR4結(jié)合可能是AS的新治療靶點(diǎn)[19]。也有研究顯示，亞臨床心血管疾病病人CXCR4表達(dá)降低，提示CXCR4可能是亞臨床心血管疾病的保護(hù)基因[20]。

綜上所述，本研究共確定了24個(gè)關(guān)鍵基因，其中文獻(xiàn)支持MMP9、CXCR4和FABP4基因與AS相關(guān)，它們可能是AS的生物標(biāo)志物。除MMP9、FABP4和CXCR4外，其他的21個(gè)基因在本研究中差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也可能與AS相關(guān)，但需要進(jìn)一步的研究來闡明這些基因與AS發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。本研究結(jié)果可為AS的分子診斷和治療開發(fā)提供算法預(yù)測(cè)和數(shù)據(jù)分析支持。

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（本文編輯 馬偉平）

[收稿日期]2019-12-04; [修訂日期]2020-04-30

[基金項(xiàng)目]山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2017LH004）

[第一作者]邵光耀（1993-），男，碩士研究生。

[通信作者]楊軍（1964-），男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。E-mail：yangjunyhd@163.com。