牛大力精油成分測定及其作用機制預測分析

李程勛 李愛萍 徐曉俞 鄭開斌

摘要：研究牛大力精油成分，并利用網絡藥理學方法初步分析其活性物質的作用機制。通過回流法提取牛大力精油，并利用固相微萃取技術對樣品進行采集，氣相色譜-質譜法（GC-MS）對樣品成分進行測定，結合計算機譜庫和人工譜圖解析對樣品成分進行鑒定，然后進一步利用藥理學分析平臺（TCMSP）結合類藥五原則和口服生物利用度篩選出牛大力精油活性成分，通過PharmMapper數據庫對活性成分的靶位點進行匹配，篩選出關鍵靶位點，通過DAVID數據平臺對關鍵靶位點進行KEGG（京都基因與基因組百科全書）通路富集分析，利用Cytoscape軟件構建活性成分-靶點-KEGG通路網絡。共測得牛大力精油化學成分65種，包括醛類、醇類、酸類、烴類、酮類和酯類等化合物，篩選出13種活性成分，主要作用于16個靶位點上，通過KEGG分析得到6條通路。牛大力精油中的活性成分鄰苯二甲酸二丁酯、水楊酸甲酯等有可能作用于GSK3B、PPP1CC等基因編碼的靶位點上，參與調控胰島素、多巴胺受體、蛋白聚糖等信號通路，從而對糖尿病、神經系統、腫瘤和癌癥等進行調控。

關鍵詞：牛大力;精油成分;網絡藥理學;作用機制;活性成分;靶位點;信號通路

中圖分類號： R284.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0217-07

收稿日期：2019-05-16

基金項目：福建省科技重大專項（編號：2018NZ0003-2）。

作者簡介：李程勛（1991—），男，福建南安人，碩士，研究實習員，主要從事作物品質育種與天然產物提取研究。E-mail：1219513539@qq.com。

通信作者：李愛萍，研究員，主要從事作物遺傳品質育種及農產品天然產物提取研究，E-mail：apl909@163.com;鄭開斌，博士，研究員，主要從事作物遺傳品質育種及農產品天然產物提取研究，E-mail：k03163@163.com。

牛大力是豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤的根，別稱大力薯、倒吊金鐘、金鐘根、山蓮藕等。常被用于中藥中，藥用價值較大，有補虛潤肺、強筋活絡之效，能夠治療肺熱、肺虛、肺結核、慢性肝炎、風濕性關節炎等疾病[1]。傳統中對于牛大力的應用多是基于其含有豐富的蛋白質、淀粉、生物堿、多種黃酮類化合物等，而對于牛大力揮發性成分的研究和應用幾乎沒有，明確牛大力精油的成分組成及其作用機制對于牛大力精油的利用具有重要指導意義，同時也可為其他中藥精油的開發和利用提供參考。近年來，國內外對植物精油的研究十分活躍，植物精油中含有豐富的芳香族、脂肪族等活性物質，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤等多種功效，已從肉桂[2]、佛手[3]、姜黃[4]、金銀花[5]、月桂、茴香、香菜[6]等大量植物中研制出了相應的精油。陳建煙等對植物精油的抗菌、抗癌、抑制腫瘤細胞生長等多種生物活性的作用機理進行了綜述[7];朱麗云等綜述了抗癌活性植物精油的主要活性成分及其作用機制[8]。國內外關于牛大力的研究主要集中在牛大力的栽培管理、藥理作用、化學成分分析和功效成分分離鑒定上，其中，鄭海等在廣東省開展了牛大力優質高產種植技術研究[9];陳晨等通過高效液相色譜（HPLC）、ICP-MES等方法測定了海南牛大力中維生素、氨基酸和礦質元素等營養成分[10];宗鑫凱等通過柱層析方法從牛大力95%乙醇提取物中分離得到異甘草素、高麗槐素、紫檀素、美迪紫檀素、高紫檀素[11];Zhao等通過單因素試驗和響應面法優化了牛大力總黃酮的提取方法，并證明了牛大力提取物具有較強的抗氧化活性[12];Yin等從牛大力中分離出了一種新的黃酮醇苷[13];齊耀群等研究表明，牛大力多糖通過促進IκB-α蛋白和抑制NF-κB p65蛋白的表達，降低了炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α的釋放，從而起到抗炎作用[14]。目前，對于牛大力精油成分和功效作用方面的研究幾乎沒有，在一定程度上限制了牛大力精油的開發利用。本研究采用氣相色譜-質譜（GC-MS）法對回流提取得到的牛大力精油成分進行鑒定分析，并利用網絡藥理學方法預測分析牛大力精油成分的功效作用及作用機制，以期為牛大力精油的開發應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

試驗材料為牛大力根切片，取自廣西中醫藥大學。

試驗儀器為GCMS-TQ8040氣相色譜質譜聯用儀（日本島津公司）;手動固相微萃取（SPME）迸樣器、固相微萃取頭[50/30 μm二乙烯基苯/Carboxen/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS），美國色譜科公司];頂空萃取瓶（20 mL，美國安捷倫科技公司）;精油回流提取器（25 L）。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛大力精油提取 將牛大力根切片置于揮發油提取罐中，按料液比1 g ∶ 10 mL加入蒸餾水，回流提取4 h，待油水分離器中油和水分離完全后，將牛大力精油分離出來。

1.2.2 SPME萃取和GC-MS分析方法 第1步，將固相萃取頭置于丙酮中浸泡30 min;第2步，將固相萃取頭接在氣相色譜儀進樣口處老化30 min（老化溫度為250 ℃）;第3步，移取5 mL牛大力揮發油置于20 mL頂空萃取瓶中，插入老化好的固相萃取頭吸附30 min（吸附溫度為60 ℃）;第4步，將吸附完成后的固相萃取頭插入氣相色譜-質譜聯用儀進樣口中解吸附3 min（250 ℃），并進行數據采集。GC條件：Rxi-5Sil MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;程序升溫：柱溫50 ℃維持2 min后，以 5 ℃/min 的速度升溫至180 ℃，再以20 ℃/min的速度升溫至 280 ℃，維持2 min;載氣為純氦氣，流量為1 mL/min，分流比為10 ∶ 1;進樣量為1 μL。質譜條件：電子轟擊電離（EI）源（電子能量為 70 eV），接口溫度為280 ℃，離子源溫度200 ℃，質譜掃描范圍為35～550 aum[15]。

1.2.3 數據處理和分析 揮發油各成分經過氣相色譜-質譜分離，通過計算機譜庫（NIST/WILEY）檢索和分析后，再進行人工譜圖分析，最終確定揮發油中各個化學成分，采用峰面積歸一化法得到各成分的相對含量。

1.2.4 牛大力精油活性成分篩選 結合中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP），通過類藥五原則（化合物成藥的必需條件）和口服生物利用度（OB>30%），篩選出牛大力精油中的活性成分。類藥五原則具體內容為（1）相對分子質量<500;（2）氫鍵供體數目<5個;（3）氫鍵受體數目<10個;（4）油水分配系數<5;（5）可旋轉鍵的數量不超過10個。符合類藥五原則的化合物成分會有更好的藥代動力學性質，在生物體內的代謝過程中有更好的生物利用度，更有可能成為口服藥物[16]。

1.2.5 牛大力精油活性成分作用靶點的預測與篩選 通過PubChem平臺查找牛大力精油活性成分的三維化合物結構圖，保存為“sdf”格式。將活性成分三維化合物結構圖以“sdf”格式輸入PharmMapper數據庫中進行靶點匹配預測（將靶點集設置為僅人類蛋白質靶點），將預測結果導出，并按對接得分Z值進行排序，每個成分選取前30個靶點用于后續研究[17-19]。

1.2.6 牛大力精油活性成分-預測靶點網絡構建 將牛大力精油活性成分和預測靶點信息導入Cytoscape 3.6.1軟件中，構建活性成分-預測靶點網絡，以探究牛大力精油的藥理學作用機制。Cytoscape 3.6.1是一個可以將互作網絡可視化的軟件，主要包括節點和連接，每個節點可以是分子、蛋白質或基因等，節點和節點之間的連接代表這些分子之間的相互作用。每一個節點都有一個度值，度值代表著節點與節點相連的數目，度值越大，則這個節點在網絡中的作用越大，如果該節點是靶點，則該靶點極有可能是化合物的關鍵靶點[20]。

1.2.7 KEGG通路富集分析 將活性成分-預測靶點網絡中節點度值大于等于5的靶點蛋白利用DAVID數據庫進行KEGG（京都基因與基因組百科全書）生物通路富集分析，篩選出P≤0.05的通路，利用Cytoscape軟件構建活性成分-靶點-KEGG通路網絡[16]。

2 結果與分析

2.1 牛大力精油化學成分分析

通過GC-MS方法共檢測出牛大力精油化學成分65種（表1），對其成分進行統計，結果見圖1。

由表1、圖1可知，共測得化學成分65種，其中醛類化合物有13種，相對含量最高，達44.11%;醇類化合物次之，有8種，相對含量為16.27%;酸類化合物有3種，含量為14.73%;烴類化合物有12種，含量為7.96%;酮類化合物有15種，含量為 4.30%;酯類化合物有8種，含量為2.74%。

2.2 牛大力精油活性成分篩選

采用類藥五原則和口服生物利用度從牛大力精油中共篩選出13種活性成分，具體見表2。

結合表1、表2可知，13種活性成分相對含量總和為48.35%，其中醛類相對含量最高，達到 27.20%，酸類含量為13.64%，醇類含量為5.19%，酮類含量為1.34%，酯類含量為0.98%。在牛大力精油成分中，活性成分相對含量占了接近50%。

2.3 牛大力精油活性成分-預測靶點網絡構建

通過PharmMapper數據庫預測牛大力精油活性成分的靶點，采用Cytoscape 3.6.1軟件制作活性成分-預測靶點網絡圖。由圖2可知，牛大力活性成分-預測靶點相互作用網絡共有177個節點， 包括13個化合物節點和164個靶點節點，在作用網絡中有16個靶點度值≥5，說明這16個靶點能與5個及以上化合物發生相互作用，具體靶點信息見表3。

2.4 牛大力精油關鍵靶點KEGG信號通路富集分析及活性成分-靶基因-通路網絡構建

通過DAVID數據平臺對牛大力精油關鍵靶點進行KEGG通路富集分析，以P≤0.05為條件篩選出6條信號通路（表4）。進一步利用Cytoscape軟件構建牛大力精油活性成分-靶基因-KEGG通路網絡（圖3）。

由圖3可以看出，牛大力精油通過13種活性成分作用于6個關鍵的靶位點上，調控著6條重要的信號通路。由表4可以看出，關鍵靶點主要涉及的通路有抗胰島素信號通路、胰島素信號通路、多巴胺受體信號通路、EB病毒感染信號通路、癌癥中蛋白聚糖的信號通路、細胞的焦點黏連信號通路。由涉及的通路可以看出，牛大力精油對于糖尿病、神經系統調節、腫瘤、癌癥等具有一定的調控作用。

3 討論與結論

3.1 牛大力精油對糖尿病的作用機制預測

牛大力現已被廣泛應用在預防和治療糖尿病的藥方中，賀勤杰將牛大力作為1種主要成分，結合丹參、天花粉等中藥在糖尿病治療中一起發揮作用[21];趙志祥等發現，由牛大力、當歸、熟地黃等組成的脈復生合劑對于治療糖尿病足的臨床療效顯著[22]。袁永春等發明了一種由牛大力、千里光、苦地丁等組成的治療糖尿病足的護理液[23];李送南發明的牛大力枸杞茶也具有治療糖尿病的功能[24]。本研究預測牛大力精油中的鄰苯二甲酸二丁酯、水楊酸甲酯、己醛、4-庚酮、Z-2-庚烯醛、反式-3-辛烯-2-酮、壬酸、己酸、1-壬醇等成分可作用于由GSK3B、PTPN1、PPP1CC基因編碼的靶位點上，參與調控抗胰島素信號通路和胰島素信號通路，對胰島素合成起到雙向調控的功能，因此對糖尿病具有調控作用。

3.2 牛大力精油對神經系統調節機制預測

牛大力與其他藥物復配能夠治療坐骨神經痛[25]、改善腓神經運動神經傳導速度和感覺神經傳導速度[22]、調節神經系統[26]等。本研究預測牛大力精油中的鄰苯二甲酸二丁酯、水楊酸甲酯、己醛、4- 庚酮、壬酸、2-十一烯醛、薄荷醇、Z-2-庚烯醛、反式-3-辛烯-2-酮、1-壬醇等成分可作用于由MAPK14、GSK3B、PPP1CC基因編碼的靶位點上，參與調控多巴胺受體信號通路，具有通過神經遞質調控中樞神經系統的生理功能。

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