新風膠囊對關節炎模型大鼠PTEN/PI3K/AKT信號通路及血小板活化的影響①

黃傳兵 萬 磊 劉 健 劉 磊

(安徽中醫藥大學第一附屬醫院，合肥 230031)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種累及多系統的、慢性、侵襲性自身免疫性疾病，四肢小關節受累最常見。滑膜組織血管新生，肥厚絨毛樣突起形成血管翳，血管翳侵蝕關節軟骨及軟骨下骨是造成RA關節功能障礙的最主要原因[1]。RA 關節外表現形式多樣，其中血小板活化較為多見[2，3]。血小板活化可發揮凝血、止血作用，但同樣參與RA炎癥反應等過程。血小板活化后可通過分泌血小板微粒(platelet microparticles，PMPs)參與RA免疫調節、血管新生等過程[4，5]。因此，觀察關節炎患者體內血小板活化產物的變化及闡明藥物干預機制意義重大。本研究采用弗氏完全佐劑構建佐劑關節炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型，采用新風膠囊(XFC)干預AA大鼠，觀察大鼠體內血小板活化物PMPs及磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phospholipase and tensin homologue，PTEN)/磷脂酰肌醇三激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶(protein kinase,AKT)信號通路等變化，探討XFC改善AA血小板活化的機制。

1 材料與方法

1.1材料 弗氏完全佐劑(批號:160861206)、PI3K特異性抑制劑LY294002(批號：52-0213)購自美國Sigma公司。Rabbit Antibody PENT、AKT、p-AKT(ser473)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關死亡啟動因子(BAD)(Rabbit Antibody)、PI3K(Mouse Antibody)、血小板來源的生長因子(PDGF)購自美國Abcam公司。BX53型顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。XL-ESPIC MCL型流式細胞儀購自美國Beckman-Coulter公司。JEM-1230型透射電子顯微鏡購自日本日立公司。

1.2方法

1.2.1模型分組 采用隨機對照表將大鼠分為正常對照(NC)組、模型對照(MC)組，PI3K阻滯劑LY294002(LY294002)組、XFC組，每組6只。各組分別給予相應藥物治療(NC、MC組給予等體積生理鹽水)，給藥30 d后觀察各項指標變化。

1.2.2流式細胞術檢測PMPs標志物 抗凝管腹主動脈采血2 ml。1 000 r/min離心20 min，上清即為富血小板血漿。取100 μl 富血小板血漿、5 μl CD61-FITC抗體、5 μl CD41-PE抗體、1 μl熒光微粒加入流式管，室溫孵育30 min，PBS定容至0.5 ml，加入1 μl熒光微粒，流式細胞儀檢測。CD61-FITC和CD41-PE雙陽性顆粒即為PMPs，檢測門內PMPs雙陽性表達率CD61+CD41+PMPs(%)。

1.2.3血小板參數檢測 采用全自動血細胞分析儀檢測血小板計數(PLT)、血小板壓積(PCT)、血小板體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)表達。

1.2.4電鏡觀察血小板超微結構變化 將采集的血液樣本加于分離液中，離心后用吸管小心吸取第一層(血小板血漿層)，加入10 ml清洗液，離心、棄上清、重懸細胞，再離心、棄上清，白色沉淀即為血小板。血小板固定、脫水、包埋，組織進行超薄切片，透射電鏡觀察攝片。

1.2.5ELISA法檢測血清細胞因子 腹主動脈采血。離心取上清，ELISA法檢測血清細胞因子血管內皮生長因子(VEGF)、缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 、內皮抑素(ES)、IL-10 OD值，查標準曲線計算VEGF、HIF-1α、TNF-α、ES、IL-10最終濃度。

1.2.6免疫組化、RT-qPCR法檢測腹主動脈組織PDGF 取腹主動脈，石蠟包埋、切片、免疫組織化學染色。PDGF抗體1∶500稀釋行染色，每張切片任選4個視野，采用圖像分析軟件進行分析，用積分光密度表示PDGF蛋白表達。腹主動脈提取RNA，引物序列如下：PDGF引物：上游5′-GTG CGG TCT TTG TTC TCC TC-3′，下游： 5′-TCG CTC TCT GTG ACA AGG AA-3′；β-actin引物：上游：5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′，下游：5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′。逆轉錄，進行PCR反應，以β-actin為內參，2-ΔΔCt計算PDGF mRNA表達。

1.2.7免疫印跡法檢測大鼠血小板細胞PTEN/PI3K/AKT蛋白表達 取上層血漿，離心，去上清。向沉淀加入血小板洗滌液輕輕搖動洗滌，再次離心，除去洗滌液。將蛋白提取液、蛋白酶抑制劑混合物加入離心管中，振蕩、混勻，離心、取上清即為血小板蛋白。轉膜、封閉、免疫反應。PTEN、PI3K、AKT、BCL-2、p-AKT、BAD抗體1∶2 000稀釋；二抗抗體1∶5 000稀釋，分析結果。

2 結果

2.1XFC對AA大鼠PMPs及血小板參數的影響 與NC組相比，MC組PMPs、PLT、PCT表達顯著升高(P<0.01)，PDW、MPV表達差異無統計學意義(P>0.05)；與MC組相比，LY294002組、XFC組PMPs、PLT、PCT表達顯著降低(P<0.01)，PDW、MPV表達差異無統計學意義(P>0.05)；XFC組、LY294002組PMPs、PLT、PCT、PDW、MPV表達差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1、表1。

2.2各組血小板超微結構的變化 電鏡下NC組

圖1 標準熒光微球定位對照及血小板微粒流式設門圖Fig.1 Standard fluorescent microsphere positioning control and platelet particle flow gate setting dragram

血小板形狀規整，表面光滑，無偽足伸出，胞質中可見α顆粒、線粒體散在分布；MC組可見血小板外形稍膨脹，不規整，表面多處偽足伸出，胞質中α顆粒、線粒體顯著減少，血小板結構破壞明顯，部分血小板表面可見PMPs形成；LY294002組血小板細胞外形不規整，少量偽足伸出，胞質中α顆粒、線粒體分布； XFC組血小板呈橢圓形，狀規整，有少許偽足伸出，胞質結構無明顯損傷、胞質α顆粒、線粒體較MC明顯增多。見圖2。

2.3XFC對AA大鼠血清細胞因子的影響 與NC組相比，MC組血清VEGF、HIF-1α、TNF-α表達明顯升高，ES、IL-10表達降低(P<0.01)；與MC組相比，LY294002組和XFC組VEGF、HIF-1α、TNF-α表達降低，ES、IL-10表達升高(P<0.05或P<0.01)；與LY294002組相比，XFC組TNF-α表達降低(P<0.05)。見表2、圖3。

2.4XFC對AA大鼠腹主動脈PDGF表達的影響

圖2 各組血小板超微結構 (×5 000)Fig.2 Platelet ultrastructure of each group (×5 000)

表1 各組血小板微粒、血小板參數變化

表2 各組血清細胞因子水平變化

免疫組化結果顯示：與NC組相比，MC組大鼠腹主動脈PDGF表達升高(P<0.01)；與MC組相比，LY294002組、XFC組PDGF表達降低(P<0.01)；LY294002組、XFC組PDGF表達差異無統計學意義(P>0.05)。RT-qPCR結果顯示：與NC組相比，MC組大鼠腹主動脈PDGF mRNA表達升高(P<0.01)；與MC組相比，LY294002組、XFC組PDGF mRNA表達降低(P<0.05或P<0.01)；與LY294002組相比，XFC組PDGF mRNA表達降低(P<0.05)。見表3、圖4。

圖3 各組血清細胞因子水平比較Fig.3 Comparison of serum cytokines levels in each group

表3 各組大鼠腹主動脈PDGF表達變化

2.5血小板細胞PTEN/PI3K/AKT蛋白變化 與NC組相比，MC組大鼠血小板細胞PI3K、AKT、p-AKT、BCL-2蛋白表達升高，PTEN、BAD蛋白表達降低(P<0.01)；與MC組相比，LY294002組、XFC組PI3K、p-AKT、BCL-2蛋白表達降低，PTEN、BAD蛋白水平升高(P<0.05或P<0.01)；XFC組與LY294002組相比PTEN、PI3K、AKT、p-AKT、BAD、BCL-2差異無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖5。

圖4 各組腹主動脈組織PDGF表達(×400)Fig.4 PDGF expressions in abdominal aorta tissues of each group (×400)

圖5 各組血小板細胞PTEN/PI3K/AKT蛋白表達Fig.5 Expressions of PTEN/PI3K/AKT protein in platelet cells of each group

表4 各組血小板細胞PTEN/PI3K/AKT蛋白表達變化

3 討論

AA大鼠外周血PMPs釋放增多，該過程受多種炎癥因子、細胞因子和信號通路共同調控。機體抑炎因子與促炎癥細胞因子平衡失衡、PI3K/AKT異常活化、凋亡指標BAD、抗凋亡指標BCL-2表達紊亂共同導致了外周血PMPs高表達，上調炎癥因子分泌，介導炎癥反應，誘導滑膜血管增生[6,7]。

PMPs是血小板細胞活化后釋放進入微循環的小囊泡，可直接活化多種單核細胞、中性粒細胞，招募炎癥趨化因子表達，分化為多種炎癥因子，參與炎癥反應。活動期RA患者外周血PMPs含量顯著高于穩定期RA患者，RA患者關節液中PMPs含量顯著高于外周血，表明PMPs與RA炎癥反應有關[8]。RA早期，PMPs可誘導關節滑膜組織產生血管內皮生長因子，進而誘導滑膜炎癥及血管增生。RA病變過程中，血小板參數PLT、PCT增高在一定程度上反映了關節滑膜侵蝕性炎癥的活動程度，本研究發現，AA大鼠PMPs、PLT、PCT表達顯著升高。既往研究發現，AA大鼠中PMPs與足跖腫脹度、AI呈正相關，說明PMPs介導關節及全身炎癥反應[9-11]。本研究發現，AA大鼠體內炎癥細胞因子VEGF、HIF-1α、TNF-α表達升高，導致AA血小板參數失衡及PMPs釋放增多,PDGF表達升高。XFC干預后血小板計數降低、超微結構破壞改善，抑制血小板細胞產生、釋放PMPs，降低炎癥因子表達，減輕全身炎癥反應，降低微血管密度，抑制血管增生和滑膜組織炎癥反應。

PI3K/AKT信號通路是重要的細胞內信號轉導通路，通過跨膜酪氨酸激酶受體和細胞內因子應答各種細胞內外信息，并調控細胞生長、增殖、分化、凋亡和細胞骨架重排等，在RA滑膜組織中廣泛存在并處于異常激活狀態，且與滑膜組織中纖維細胞樣滑膜細胞凋亡有關[12,13]。本研究發現，AA大鼠機體促炎因子表達增多，激活PI3K/AKT信號通路形成正反饋，進一步促進PMPs釋放，血小板細胞PI3K/AKT通路被異常激活。因此，抑制異常活化的PI3K/AKT 信號通路或抗凋亡分子的表達可以誘導RA細胞凋亡，抑制PDGF表達，治療RA。LY294002為PI3K/AKT信號通路特異性抑制劑，可抑制PI3K/AKT通路激活[14]。采用LY294002處理的關節炎模型小鼠可顯著改善關節滑膜增生，抑制滑膜內炎癥細胞浸潤產生抗炎作用。本研究發現，XFC和LY294002均可調節PI3K、p-AKT、BCL-2、PTEN、BAD表達，XFC可通過上調PTEN，負性調節PI3K/AKT通路，降低BCL-2表達，升高BAD，改善血小板參數，抑制血小板活化，下調PMPs表達，抑制PMPs介導的炎癥反應。

綜上所述，XFC可通過抑制血小板PTEN/PI3K/AKT信號通路，提高抑炎因子表達，調節Th1/Th2平衡，降低炎癥因子表達，減輕全身炎癥反應，降低PMPs表達，改善血小板參數，從而抑制RA患者炎癥反應。