約氏瘧原蟲蛋白磷酸酶6免疫血清的傳播阻斷效果分析①

楊慧琳 周 丹 于園超 朱曉彤 崔立旺

(中國醫科大學免疫學教研室，沈陽 110122)

傳播阻斷疫苗(transmission blocking vaccine，TBVs)通過瘧原蟲有性階段抗原激活機體免疫系統，因此，影響其有性發育過程會起到阻斷瘧疾傳播效果。由于TBVs候選抗原表達于蚊階段，不受人體免疫系統選擇壓力的影響，因此具有低多態性和良好的免疫原性等特點[1]。經典的TBVs候選抗原包括：配子受精前期靶抗原P45/48、P230，受精后期靶抗原P25、P28和蚊中腸靶抗原HAP2[2-6]。雖然P45/48和P230具有明顯的傳播阻斷效果，但由于兩者在體外表達時無法正確折疊而阻礙了其發展[7-10]。P25和P28為動合子表面蛋白，有研究證實，抗-Pbs25/28免疫血清可完全阻止瘧原蟲在蚊體內的發育[11]。Pvs25已經進入了Ⅰ期臨床試驗，其疫苗可減少80%的卵囊形成，但其傳播阻斷效果未達到100%。因此，探索新的TBVs候選抗原可為研發高效瘧疾傳播阻斷疫苗提供理論基礎。

蛋白質的磷酸化與去磷酸化是細胞信號轉導過程中最重要的調控方式，其參與細胞周期調控的各方面[12-14]。蛋白激酶(protein kinase,PK)與蛋白磷酸酶(protein phosphatase,PP)負責調控這一過程的平衡，前者啟動蛋白的磷酸化，后者促發蛋白的去磷酸化[15]。蛋白激酶已被公認為重要的治療靶點，但蛋白磷酸酶只是作為臨床干預靶標[16]。近幾年，關于瘧原蟲PP的研究已成為熱點。根據氨基酸序列的同源性、結構特征及催化機制的不同，PP可以分為四大家族:磷酸化絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶(phosphoserine and phosphothreonine residues phosphatases,PPPs)、磷酸化酪氨酸蛋白磷酸酶(phosphotyrosine residues phosphatases,PTPs)、Mg2+依賴的磷酸化絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶(Mg2+-dependent phosphoserine and phosphothreonine residues phosphatases,PPMs)和NLI相互作用因子樣磷酸酶(NLI-interatcting factor-like phosphatases,NIFs)[17]。PPM6屬于PPM/PP2C家族，其研究尚處于起步階段。

本項目采用生物信息學方法選取約氏瘧原蟲PPM6(Plasmodiumyoeliiprotein phosphatase PPM6 (PyPPM6)，PlasmoDB accession no.PY02322)，探究其是否具有阻斷傳播效果。

1 材料與方法

1.1材料 6～8周齡雌性BALB/c小鼠由北京實驗動物研究所提供；雌性中華按蚊、P.y17XNL原蟲株及其基因組DNA(gDNA)均由中國醫科大學免疫教研室保存；KOD-Plus-Neo 購自Toyobo 公司；限制性內切酶BamHⅠ 和NotⅠ、T4 DNA 連接酶、TaKaRa Agarose Gel DNA Extraction Kit v4.0 購自TaKaRa公司；快速質粒小提試劑盒購自天根公司；LB Broth 購自Solarbio 公司；氨芐青霉素購自GENVIEW 公司；1640 培養基購自Gibco公司；胎牛血清、IPTG購自Hyclone公司；脫脂奶粉購自BD DifcoTMSkim Milk 公司；Tween-20購自北京鼎國公司；HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads、Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody、PierceTMECL Plus Western Blotting Substrate、HRP、6×His Tag Mono-clonal Antibody購自Thermo Fisher公司。

1.2方法

1.2.1PyPPM6基因合成及原核表達載體構建 將1×107P.y17XNL原蟲通過腹腔注射感染小鼠，3 d后，取50 μl尾血提取基因組DNA(gDNA)。以 gDNA為模板，采用引物：PyPPM6-BamHⅠF：5′-cgggatccAAAAATACATTTTTTTATAAGTCCC-3′；PyPPM6-NotⅠR：5′-ttgcggccgcTCGTTCCCATCTTCTCCATGA-CTCT-3′，擴增PyPPM6功能區域(359-644 aa)。將上述PCR產物純化后經限制性內切酶BamHⅠ和NotⅠ酶切。同時，pET32a(+)原核表達載體經BamHⅠ和NotⅠ酶切，37℃孵育2 h，純化。用T4連接酶連接酶切后的PCR產物和pET32a(+)載體，16℃過夜，將連接產物轉化至宿主菌Rosetta(DE)Competent Cell。菌落PCR鑒定，選取陽性克隆株進行小搖擴增。用快速質粒小提試劑盒提取質粒，送華大基因公司測序。采用MEGA7.0軟件對測序結果進行比對分析。

1.2.2重組蛋白的表達與純化 選取pET32a(+)-PyPPM6陽性克隆于3 ml LB培養基中，220 r/min、37℃過夜。取1 ml菌液于250 ml LB培養基中，37℃，220 r/min離心3 h，加入250 μl 1 mmol/L IPTG于20℃孵育16～18 h誘導PyPPM6-His重組蛋白(rPyPPM6-His)，采用HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads純化重組蛋白。將純化后的重組蛋白進行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，25 V電壓下半干法轉PVDF膜30 min。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，TBS-T洗3次，每次10 min。采用抗-His標簽抗體6×His Tag Monoclonal Antibody(1∶2 000)室溫孵育1 h。之后采用HRP標記的山羊抗小鼠IgG室溫孵育1 h。ECL發光后采用熒光圖像分析系統檢測結果。

1.2.3實驗動物免疫 6～8周齡BALB/c雌性小鼠隨機分成2組，每組10只。組1為rPyPPM6-His免疫組(PyPPM6)；組2為PBS免疫組(NC)。采用50 μg 重組蛋白免疫小鼠。初次皮下免疫每隔周免疫1次，共免疫3次，每次免疫后第10天收集各組免疫血清。初次免疫采用弗氏完全佐劑，二免和三免采用弗氏不完全佐劑混合。

1.2.4血清特異性抗體水平檢測 將10 μg的rPyPPM6-His重組蛋白溶解于碳酸鹽緩沖液(pH=7.4)包被96孔酶標板，4℃過夜。采用含1%BSA的PBS封閉，37℃孵育1 h。PBS洗3次，加入用PBS緩沖液連續倍比稀釋抗-PyPPM6免疫血清，100 μl/孔，37℃孵育2 h。PBS洗3次，加入1∶5 000的HRP標記的山羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h。PBS洗5次，加入底物鄰苯二胺和過氧化氫進行顯色反應，酶標儀檢測492 nm處OD值。

1.2.5抗-PyPPM6免疫血清對瘧原蟲性階段抑制效果的觀察 用1×107個P.y17XNL感染BALB/c小鼠，感染后第3天，感染率達到5%左右時，取10 μl 尾血與40 μl動合子培養基混合，并將抗-PyPPM6免疫血清按1∶5 稀釋加至動合子培養基中，25℃孵育15 min。取1 μl混合液涂片，30 min內油鏡下計數雌雄配子體數和雌雄配子數以及出絲中心數；取10 μl尾血與90 μl動合子培養基混合，將抗-PyPPM6免疫血清按1∶5 稀釋加到動合子培養基中，25℃孵育24 h。用抗-Pys25抗體固定和標記培養物進行間接免疫熒光實驗，于熒光顯微鏡下計動合子數并計算動合子轉化率；1×107個P.y17XNL感染BALB/c小鼠，感染后第3天，感染率達到3%左右，尾靜脈注射免疫血清1 h后，置于饑餓12 h的雌性按蚊籠中吸食血液1 h。7 d后解剖蚊胃，計數蚊胃壁的卵囊數。

1.3統計學處理 本研究中實驗數據處理和統計學分析均采用GraphPad Prism 6.0統計軟件。其中，配子體出絲和動合子數量比對分析采用Student′st檢驗。卵囊密度組間比較采用Mann-Whitney U檢驗分析。

2 結果

2.1PyPPM6重組蛋白表達與免疫血清制備 本研究成功構建pET32a (+)-PyPPM6原核表達載體。SDS-PAGE電泳后，可見大量PyPPM6重組蛋白(～40 kDa)表達(圖1A、B)。ELISA結果顯示，抗-PyPPM6免疫血清抗體滴度為1∶64 000(圖1C)。

2.2抗-PyPPM6免疫血清對雄配子體出絲的影響P.y17XNL原蟲體外配子體出絲實驗觀察發現，與對照組(PBS免疫血清)相比，1:5倍稀釋后的抗-PyPPM6免疫血清可使雄配子體出絲數目下降78.8%，差異有統計學意義(P<0.01，圖2)。

2.3抗-PyPPM6免疫血清對體外動合子發育的影響 與PBS對照組相比，抗-PyPPM6免疫血清處理組動合子數目下降78.7%(P<0.000 1，圖3A)；動合子轉化率下降55.1%，差異均有統計學意義(P<0.000 1，圖3B)；間接免疫熒光實驗結果如圖3C。

2.4抗-PyPPM6免疫血清對蚊胃內囊合子形成的影響 蚊胃內囊合子形成實現結果發現：與對照組相比，吸食抗-PyPPM6免疫血清實驗組小鼠血液的按蚊胃內囊合子形成減少40.4%，差異有統計學意義(P<0.000 1，圖4)。

圖1 PyPPM6重組蛋白表達檢測Fig.1 Detection of PyPPM6 recombinant protein expression

圖2 抗-PyPPM6免疫血清對雄配子體出絲的影響Fig.2 Effect of anti-PyPPM6 serum on male gametocyte exflagellation

圖3 抗-PyPPM6血清對動合子數目和轉化率的影響Fig.3 Effect of anti-PyPPM6 serum on ookinete number and ookinete conversion rate

圖4 抗-PyPPM6血清對囊合子形成的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of anti-PyPPM6 serum on oocysts formation

3 討論

可逆的蛋白磷酸化是多個細胞進程的關鍵，催化磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶已被明確為多種疾病的藥物靶點[18]。瘧原蟲磷酸酶蛋白質組學研究顯示，瘧原蟲約含有30種磷酸酶，其中50%以上的磷酸酶為紅內期生長發育必需蛋白[16]，然而，磷酸酶在有性發育過程中的作用尚不完全清楚。研究已知：PPM1與雄配子體出絲有關、PPM2與動合子轉化有關[16]，PP5與雄配子形成有關[18]。

本課題組前期研究發現，PyPPM6蛋白主要表達在原蟲有性發育階段(結果未顯示)。本研究中，PyPPM6重組蛋白免疫小鼠后，ELISA檢測發現抗-PyPPM6特異性抗體水平顯著升高。同時，Western blot結果顯示抗-PyPPM6免疫血清能夠特異性結合內源性PyPPM6蛋白。以上實驗結果提示約氏瘧原蟲PyPPM6重組蛋白免疫后的抗血清具有良好的免疫原性和反應原性，為其作為傳播阻斷疫苗候選抗原提供了理論基礎和實驗依據。目前傳播阻斷疫苗候選抗原包括來自受精前階段抗原(例如 P230，P48/45)[19]，其具有加強免疫的優勢。 抗Pfs230和Pfs48/45血清能夠阻止卵囊形成，具有明確的傳播阻斷活性[20，21]；與之相比 ，抗-PyPPM6免疫血清在體外可顯著抑制配子體出絲，抑制率達到78.8%，提示其可抑制雄配子體發育，并可能影響后續發育階段中的雄/雌配子體受精過程，具有一定的傳播阻斷活性。

為明確PyPPM6免疫血清的傳播阻斷效果，本研究分別進行體外動合子培養和蚊胃內卵囊形成實驗。與對照組相比，當在動合子培養基中加入1:5稀釋的抗-PyPPM6免疫血清時，動合子形成顯著減少，提示其可能抑制動合子形成。蚊體內卵囊形成實驗顯示，抗-PyPPM6血清可顯著抑制蚊胃內卵囊的形成。目前傳播阻斷疫苗候選抗原還包括來自受精后階段抗原(例如 P25，P28)[21]，其可以延長抗體阻斷作用的時間。抗Pfs25抗血清能夠完全抑制卵囊的形成，抗Pvs25抗血清能夠抑制80%卵囊的形成，具有明確的傳播阻斷活性[11,22,23]；與之相比，抗-PyPPM6血清可顯著抑制動合子及卵囊的形成，抑制率分別為78.7%和40.4%，具有一定的傳播阻斷活性。

綜上所述，通過對約氏瘧原蟲PPM6蛋白免疫小鼠后的免疫功能特點以及傳播阻斷效應的研究，證實了約氏瘧原蟲PPM6具有良好的免疫原性和免疫反應性。通過鼠瘧模型確定了約氏瘧原蟲PPM6蛋白作為新的TBVs候選抗原的傳播阻斷能力，為惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲PPM6蛋白作為瘧疾傳播阻斷疫苗候選抗原的可行性研究提供了堅實的理論基礎和實驗依據。