青藤堿抑制CaN/NFAT通路信號抑制CIA骨破壞的研究①

張浩然 吉金雨 侯曉強 顏 嵐 梅志剛 馮知濤

(三峽大學醫學院國家中醫藥管理局中藥藥理科研三級實驗室，宜昌 443002)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的慢性自身免疫性疾病，骨破壞是其最主要的特征之一[1]。骨破壞對關節的進行性損傷不僅會導致后期的功能障礙，還會帶來巨大的經濟負擔[2]。大量破骨細胞(osteoclast，OC)的形成是骨破壞的主要原因，目前的骨保護措施是抑制其分化成熟[3]。

青藤堿(sinomenine，SIN)是在中國傳統中藥青風藤中提取的一種生物堿單體，是青風藤中的主要有效成分，具有鎮痛、抗炎、免疫抑制等多種藥理作用，自1921年，Ishiwari首次提取出該成分，用于RA的治療已有近百年的歷史[4-6]。臨床研究表明，SIN可有效延緩RA骨破壞的進程，改善關節腫脹狀態[7-9]；在基礎研究中，SIN亦可通過抑制OC分化相關因子和信號通路降低膠原誘導性關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)骨破壞[10-12]。活化T細胞核轉錄因子c1(nuclear factor of activated T cells，cytoplasmic 1，NFATc1)作為OC分化下游的重要轉錄因子，其可被鈣調磷酸酶(calcineurin，CaN)活化進而促進OC分化成熟[13,14]。正常骨處于由成骨細胞(osteoblast，OB)介導的骨形成和OC介導的骨吸收組成的動態平衡。然而，在RA中大量OC的分化成熟導致該動態平衡失衡，進而導致了骨破壞[15]。有研究表明，CaN活化后可增加NFATc1蛋白表達水平加劇骨破壞[16]。此外，CaN基因敲除后可降低NFATc1蛋白表達水平從而延緩骨破壞[17]。提示CaN/NFAT信號通路在RA骨破壞中至關重要。然而，SIN雖可有效抑制RA骨破壞，但與CaN/NFAT的關系尚未闡明。為進一步探討SIN是否可通過CaN/NFAT信號通路降低RA骨破壞，本研究建立了CIA模型，以期為臨床運用SIN治療RA提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠60只，體質量(20±1)g，購自湖北省疾病預防控制中心，動物合格證號：SYXK(鄂)2017-0061。實驗期間飼養于三峽大學實驗動物中心，保持環境恒溫恒濕，自由飲水，飼料固定。本研究方案經三峽大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2試劑與儀器 主要試劑：完全弗氏佐劑(complete freund′s adjuvant，CFA)、不完全弗氏佐劑(incomplete freund′s adjuvant，IFA)、牛二型膠原(collagen Ⅱ，CⅡ)購自美國Chondrex公司；SIN購自美國Selleckchem公司；DMSO購自美國Sigma公司；小鼠單抗NFATc1購自英國Abcam公司；兔多抗CaN購自proteintech公司；HRP標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗小鼠IgG購自谷歌生物有限公司。主要儀器：酶標儀購自奧地利TECAN公司；磁力攪拌器購自上海滬西分析儀器廠；搖床、掌型離心機購自中國其林貝爾公司；Western blot垂直電泳槽、Western blot電轉儀購自北京六一儀器廠；化學發光呈像系統購自上海歐翔儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機購自中國格瑞恩科技有限公司；電子天平購自中國梅特勒-托利多儀器有限公司；脫水機(TP1020)、超薄切片機、倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司；光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1CIA模型的制備 雄性C57BL小鼠60只，小鼠適應性喂養1周后，隨機選取6只為正常組，其余小鼠為造模組(排除造模失敗小鼠)。根據文獻[18]，取等體積CⅡ和CFA混合置于5 ml玻璃注射器，反復抽吸30 min(冰上操作)，直至混合物完全、充分乳化，以乳化物滴入水中不松散為度，制成抗原。造模小鼠尾根部注射抗原0.1 ml。3周后加強免疫，取CⅡ與等體積的IFA混合注射，造模小鼠尾根部再次注射抗原0.1 ml；正常組不予以任何處理。加強免疫后，剔除發病不明顯小鼠。將造模成功的小鼠隨機分為模型組(M組)、青藤堿低劑量組(SL組)、青藤堿高劑量組(SH組)各9只。

1.2.2給藥方法 初次免疫后第31天起，SL和SH組小鼠給予SIN 30 mg/kg、300 mg/kg灌胃，總共給藥12 d，1次/d。C組、M組給予等體積的生理鹽水，給藥時間與SL組、SH組相同。

1.2.3關節炎指數評分方法 每日觀察并記錄全身關節病變程度。全身等級按5級評分評價，計算出關節炎指數(arthritis index，AI) 。AI評分標準如下：0分：無紅腫；1分：足小趾關節紅腫：2分：小趾和足跖關節紅腫；3分：踝關節以下的足爪均紅腫；4分：包括踝關節在內的整個足爪全部紅腫或者出現畸形。四肢評分之和(最高16分)為AI。AI越高，表明關節炎程度越嚴重[7]。

1.2.4小鼠關節病理切片 小鼠處死后，取雙后肢踝關節，于4%多聚甲醛中固定、常規脫鈣、脫水、石蠟包埋，切片后，光學顯微鏡觀察病理組織學變化：①炎癥細胞：關節有無炎癥細胞浸潤或纖維化；②滑膜組織：關節滑膜細胞有無變性，滑膜血管數量有無增多；③骨破壞：關節腔有無消失、纖維化，軟骨有無破壞或纖維化。HE染色病理切片指標評分標準如下：0分正常；1分輕度；2分中度；3分重度，每只小鼠足爪單個指標得分≤3分[19]。

1.2.5免疫組化 選取小鼠滑膜組織切片，60℃烤箱烘烤1～2 h，常規脫蠟；0.01 mol/L、pH 6.0檸檬酸微波修復后取出玻片置于濕盒中PBS沖洗3次；干燥玻片周圍組織，配置3%H2O2室溫孵育，PBS沖洗3次(10 min/次)；正常山羊血清室溫封閉30 min；棄去封閉液，滴加兔多抗CaN(1∶200)、小鼠單抗NFATc1(1∶200)，4℃過夜；取出玻片，PBS沖洗3次(10 min/次)，滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體(1∶200)、山羊抗小鼠抗體(1∶200)，室溫孵育1 h，PBS沖洗3次(10 min/次)；配置DAB顯色液，現配現用，鏡下調節顯色適宜后流水沖洗，雙蒸水潤洗；蘇木精復染細胞核2～3 min；常規脫水、透明、干燥、封片。每組隨機抽取3個樣本，每個樣本選取5個不同部位，于光學顯微鏡下觀察并采集圖像，Image-Pro Plus圖像分析軟件計算陽性率。

1.2.6Western blot檢測CIA小鼠踝關節滑膜組織中CaNAα、NFAT的蛋白表達 選取小鼠四肢關節組織20～40 mg制備樣品，用BCA蛋白試劑盒進行蛋白定量；10%SDS-PAGE電泳分離，將分離的蛋白轉移至PVDF膜，5 %脫脂奶粉封閉1 h，加入兔多抗CaN(1∶1 500)、小鼠單抗NFATc1(1∶250)，4℃孵育過夜，TBST充分洗膜3次(10 min/次)。將PVDF膜分別封入山羊抗兔抗體(1∶1 500)、兔抗小鼠抗體(1∶3 000)，室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜3次(10 min/次)。將ECL顯影液按照A液：B液=1∶1的比例配置發光液，將其均勻滴在PVDF膜上，放入凝膠成像儀器內顯影。以β-actin作為內參，實驗重復3次，Image J軟件計算各條帶灰度值，結果以目的蛋白與內參蛋白之比表示。

2 結果

2.1關節炎評分與關節炎指數變化趨勢 加強免疫后每天進行AI評分，關節炎評分標準如圖1A所示，0∶0分；1∶1分；2∶2分；3∶3分；4∶4分。統計結果如圖1B所示，造模后第37天，與C組相比，M組AI評分明顯升高(P<0.01)；與M組相比，SL組、SH組AI評分明顯降低，且呈劑量依賴性，差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。造模后第39天，與C組相比，M組AI評分明顯升高(P<0.01)；與M組相比，SL組、SH組AI評分明顯降低，且呈劑量依賴性，差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。造模后第41天，與C組相比，M組AI評分明顯升高(P<0.01)；與M組相比，SL組、SH組AI評分明顯降低，且呈劑量依賴性，差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。

2.2HE染色及病理評分 如圖2A所示，C組踝關節組織結構清楚完整，關節軟骨表面光滑，滑膜細胞無增生、充血、水腫，無炎癥細胞浸潤，軟骨細胞呈橢圓形，排列整齊。M組提示關節軟骨及骨組織破壞明顯，關節滑膜細胞大量增生，纖維組織增生充血、水腫，大量炎癥細胞浸潤，關節鄰近骨組織也有明顯破壞吸收，可見增生的纖維組織向骨髓腔內侵入生長；與M組比，SL組小鼠踝關節炎癥細胞浸潤減少，軟骨及骨組織破壞有所改善，SH組小鼠踝關節炎癥細胞浸潤明顯降低，骨破壞明顯減輕，表面光滑。病理評分統計結果如圖2B，與C組相比，M組炎癥細胞浸潤、軟骨及骨破壞評分均顯著增加，差異具有統計學意義(P均<0.01)；與M組相比，SL、SH組炎癥細胞浸潤、軟骨及骨破壞評分均有所降低，差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。

圖1 關節炎評分及其變化趨勢Fig.1 Arthritis index and its trends of each group

圖2 各組病理染色結果及評分(×400)

圖3 免疫組化檢測CaNAα、NFAT蛋白表達情況(×400)

圖4 Western blot檢測CaNAα、NFAT蛋白表達情況Fig.4 Protein expressions of CaNAα and NFAT by Western blot

2.3免疫組化檢測CaNAα、NFAT蛋白表達 各組結果如圖3A所示，陽性表達呈棕黃色點狀；與C組相比，M組CaNAα、NFAT表達顯著上調(圖3B，P<0.01)；給予SIN治療后，與M組相比，SL、SH組CaNAα、NFAT表達顯著下調，且呈劑量依賴性(圖3B，P<0.01)。

2.4Western blot檢測CaNAα、NFAT蛋白表達 與C組相比，M組CaNAα、NFAT蛋白表達顯著上調(P<0.01)；與M組相比，SL、SH組CaN、NFAT蛋白表達顯著下調，差異有統計學意義(圖4，P<0.01)。

3 討論

RA是一種臨床常見的自身免疫性疾病，其基本病理特征包括慢性滑膜炎、滑膜增生、血管翳形成及骨和軟骨的破壞，導致關節功能障礙等社會負擔[20]。2012年流行病學調查指出，我國RA患病率約占總人口的1%，女性略高于男性，并存在區域差異[21]。延緩骨及骨質的破壞，迅速達到低疾病活動狀態是目前的主要治療目標。近期研究表明，OC是導致骨破壞的主要原因，大量細胞因子和信號通路影響其分化成熟[12]。其中，CAN/NFAT信號通路在OC分化過程中發揮重要作用。

CaN是一種Ca2+依賴型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，其是一種異源二聚體，主要由與CaNB、鈣調蛋白(calmodulin，CaM)相結合的催化亞基CaNA和與Ca2+相結合的調節亞基CaNB組成[22]。CaNA由CaNAα、CaNAβ、CaNAγ三個基因編碼，但與Ca2+信號相關的是CaNAα基因[23]。細胞外的Ca2+通過其釋放活化的鈣通道(calcium-release activated calcium，CRAC)流入細胞質，與CaM、CaNB相結合導致CaNA的構象發生變化，徹底激活CaN[24]。未活化的NFATc1一般存在于細胞質中，處于高度磷酸化的狀態。被激活的CaN會活化其下游蛋白NFATc1進而入核表達，促進OC分化成熟[25]，最終導致大量OC形成，對骨關節產生破壞。Sun等[26]通過應用CaNAα抑制劑及敲除CaNAα基因的方式，發現RAW-C3細胞由于NFATc1表達的降低，分化為OC的能力顯著下降[27]。此外，缺乏NFATc1信號激活的破骨細胞前體在RANKL存在的情況下無法完成正常分化。提示NFATc1可能是CaN/NFAT信號通路整合RANKL信號、調控OC終末分化的最重要轉錄因子。有研究表明，黃芩苷、大麻素受體2激動劑、圣草酚均可通過抑制NFAT的活性降低骨破壞[28-30]，提示NFAT與骨破壞密切相關。此外，Liu等[31]研究發現，光色素可通過降低CaN、NFAT的表達減少CIA小鼠骨破壞。Guo等[32]發現，環孢素A亦可通過抑制CaN/NFATc1信號通路活性降低CIA骨破壞。以上研究表明，抑制CaN/NFAT信號通路，從而抑制OC分化，進而阻止關節炎骨破壞至關重要。

SIN是在中國傳統中藥青風藤提取的一種生物堿單體，是青風藤的主要有效成分，具有良好的抗炎、鎮痛、免疫抑制作用及較低的毒副作用[32]。既往研究表明，SIN聯合MTX、針刺、烏頭原堿均可有效緩解RA患者骨破壞進程，改善關節腫脹[7-9]。此外，SIN可通過抑制OC分化相關信號通路核轉錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)、janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子(janus kinase/signel transducers and activators of transcription，JAK/STAT)降低CIA小鼠骨破壞[33-35]。然而，SIN雖可有效延緩RA骨破壞，但其與CaN、NFAT的調控是否相關尚不清楚。因此，本實驗通過建立CIA模型，探討SIN是否可通過調控CaN/NFAT信號通路來降低CIA骨破壞。

本研究表明SL組和SH組小鼠關節炎癥狀與模型組相比CIA 顯著減輕，SIN在治療效果上呈現出藥物劑量依賴性。通過HE染色和病理評分可以觀察到模型組關節組織出現高度異常的病理變化，如血管翳形成和關節軟骨破壞等。相反，SL組、SH組表現為滑膜細胞浸潤、血管翳形成減少、骨和軟骨破壞降低，且呈劑量依賴性。以上結果進一步證實SIN抑制CIA炎癥進展和骨破壞。由免疫組化、WB結果可知，CaN、NFAT蛋白表達水平在正常組表達較低，在CIA模型組表達明顯，SL組、SH組均可降低CaN、NFAT表達，尤其SH組較為明顯。因此，SIN可能是通過抑制CaN/NFAT信號通路，進而抑制OC分化，以此達到治療關節炎骨破壞的目的。綜上所述，CaN/NFAT是OC分化的重要信號通路，SIN可通過抑制CaN/NFAT信號通路活性，減少了OC分化，進而抑制RA骨破壞。此外，在SIN給藥期間，小鼠未出現明顯不良反應，表明SIN安全性良好。但本實驗未使用陽性對照組，還需要進一步實驗證實。