銀杏總黃酮抑制心肌細(xì)胞過度自噬對(duì)缺血性心力衰竭大鼠心肌重塑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)節(jié)①

劉永強(qiáng) 劉 輝 韓培立 周朝元 崔勤濤

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心外科,新鄉(xiāng) 453100)

心力衰竭是指心臟收縮、舒張功能障礙，導(dǎo)致靜脈系統(tǒng)血液淤積、動(dòng)脈系統(tǒng)血液灌注不足，常見于心臟疾病終末段，是導(dǎo)致心血管疾病患者死亡的主要因素之一，嚴(yán)重危害公共健康。心肌重塑是其病理基礎(chǔ)之一，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬在心肌重塑中起重要作用[1，2]。銀杏總黃酮(total flavone of ginkgo biloba，TFG)是銀杏葉提取物主要活性成分，可改善腦血管循環(huán)、保護(hù)腦細(xì)胞、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、提高免疫力，可通過調(diào)節(jié)自噬減輕心肌缺血再灌注損傷，但TFG介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬對(duì)心力衰竭影響的報(bào)道較少[3,4]。本研究擬分析TFG對(duì)IHF大鼠心肌重塑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，為心力衰竭臨床藥物開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠60只，雌雄不限，體質(zhì)量(220±20)g，由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SXCN(鄂)2018-0137，按組別分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，自由攝食飲水。

1.1.2試劑與儀器 TGF、美托洛爾片購(gòu)自阿斯利康制藥有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；qRT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司；小動(dòng)物心電圖機(jī)購(gòu)自美國(guó)ECGenie公司。

1.2方法

1.2.1模型構(gòu)建 吸入乙醚法麻醉大鼠，取仰臥位固定，剃去胸前部毛備皮，自左側(cè)3～4肋間作切口開胸，小心暴露心臟，于冠狀動(dòng)脈左前降支起始部位結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，排出心包腔內(nèi)血液和氣體，關(guān)閉胸腔縫合。缺血性心力衰竭(ischemic heart failure，IHF)建模成功標(biāo)志：肢體導(dǎo)聯(lián)Ⅱ?qū)?lián) ST 段出現(xiàn)上抬[5]。空白對(duì)照組大鼠行假手術(shù)，僅穿線不結(jié)扎，其他操作一致。術(shù)后行常規(guī)抗感染處理，并保溫。

1.2.2分組與給藥 60只Wistar大鼠分為空白對(duì)照組(Control)、模型組(IHF model)、給藥組(25 mg/kg，100 mg/kg TFG)和美托洛爾組[Metoprolol 12 mg/(kg·d)]，每組12只。TFG組和Metoprolol組于建模前灌胃處理，連續(xù)7 d，1次/d，Control組和IHF model組給予等體積生理鹽水，手術(shù)結(jié)束后正常飼養(yǎng)4周，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3HE染色觀察心肌組織損傷 術(shù)后4周處死大鼠，取左心室組織，固定于多聚甲醛，脫水、透明，常規(guī)石蠟包埋切片(3 μm/片)，HE染色，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)視野，觀察病理組織改變情況。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)心肌組織Caspase-3 mRNA表達(dá) 術(shù)后4周處死大鼠，取左心室組織，液氮研磨法磨成粉末，冰上加入Trizol裂解液提取總RNA，并檢測(cè)其純度、濃度和完整性；取2 μg提取RNA液逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入熒光染料進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，95℃ 5 s，95℃ 10 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)38次。Caspase-3引物序列參考文獻(xiàn)[6]：F-5′-ATGGAGAACAATAA-AACCT-3′，R-5′-CTAGTGATAAAA-GTAGAGTTC-3′；GAD PH引物序列：F-5′-ACTCACTCTTCTACCTTTG-ATGCT-3′，R-5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCA-3′。2-ΔΔCT法計(jì)算Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5免疫組化檢測(cè)心肌組織Caspase-3 蛋白表達(dá) 左心室組織切片脫蠟、水化，滴加封閉通透液浸潤(rùn)，避光處理30 min，內(nèi)源性過氧化物酶封閉；置于檸檬酸鈉緩沖液中煮沸30 min，進(jìn)行抗原修復(fù)；5%羊血清封閉非特異性蛋白，室溫孵育30 min；加入一抗(1∶100)4℃孵育過夜；加入二抗37℃孵育30 min；加入SP 37℃孵育；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明后封片；Caspase-3染色定位于胞漿，呈黃色或棕色。染色結(jié)果評(píng)分：染色呈黃色或棕色為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞占比<10%為陰性，陽性細(xì)胞占比≥10%為陽性[7]。2名病理醫(yī)師獨(dú)立判定，并共同給出最終結(jié)果。

1.2.6心臟超聲心動(dòng)圖檢查大鼠心肌功能 術(shù)后4周采用小動(dòng)物心電圖機(jī)檢測(cè)各組大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)、左室壁厚度(left ventricular wall thickness，LVWT)、左心室收縮期末容積(left ventricular end systolic volume，LVESV)、左心室舒張末容積(left ventricular end dia-stolic volume，LVEDV)，IHF model組大鼠LVEF≤45%表示造模成功[8]。

1.2.7Western blot檢測(cè)ERS和自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 術(shù)后4周處死大鼠，取左心室組織研磨成粉末，冰上加入RIPA裂解液提取總蛋白，并檢測(cè)其濃度：取30～50 μg提取蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜后浸于5%脫脂奶粉中封閉，室溫孵育2 h，洗膜后置于相應(yīng)一抗4℃反應(yīng)過夜，洗膜后室溫孵育二抗40 min，ECL發(fā)光液顯影。

2 結(jié)果

2.1TFG對(duì)IHF大鼠心肌損傷的影響 HE染色顯示，Control組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)律整齊，細(xì)胞間隙正常；IHF model組大鼠部分心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，排列明顯紊亂，細(xì)胞間隙增大；TFG給藥組心肌細(xì)胞排列趨于整齊，細(xì)胞間隙明顯減少，高劑量組改善效果與Metoprolol組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且明顯優(yōu)于低劑量組，見圖1。

2.2TFG對(duì)IHF大鼠心肌組織Caspase-3表達(dá)的影響 免疫組化染色顯示，Caspase-3陽性表達(dá)定位于胞漿；與Control組相比，IHF model組大鼠心肌組織Caspase-3表達(dá)顯著上升(P<0.05)；與IHF model組相比，TGF組Caspase-3表達(dá)顯著下降(P<0.05)，且高劑量組改善效果與Metoprolol組相近，明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)，見圖2。

圖1 TFG對(duì)IHF大鼠心肌損傷的影響(HE，×200)Fig.1 Effects of TFG on myocardial injury in IHF rats(HE，×200)

圖2 TFG對(duì)IHF大鼠心肌組織Caspase-3表達(dá)的影響Fig.2 Effects of TFG on Caspase-3 expression in myocardial tissues of IHF rats

圖3 TFG對(duì)IHF大鼠心功能指標(biāo)的影響Fig.3 Effects of TFG on cardiac function indexes in IHF rats

2.3TFG對(duì)IHF大鼠心功能指標(biāo)的影響 與Control組相比，IHF model組大鼠LVWT、LVWF、FS明顯降低，LVESV、LVEDV顯著升高(P<0.05)；與HIF model組相比，TGF組LVWT、LVWF、FS明顯升高，LVESV、LVEDV顯著降低(P<0.05)，且高劑量組改善效果與Metoprolol組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)，見圖3。

2.4TFG對(duì)IHF大鼠心肌組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響 與Control組相比，IHF model組大鼠心肌組織CHOP、cleaved Caspase-12表達(dá)顯著升高，GADD34、Bip表達(dá)顯著下降(P<0.05)；與IHF model組相比，TFG組CHOP、cleaved caspase-12表達(dá)顯著下降，GADD34、Bip表達(dá)顯著上升(P<0.05)，且高劑量組改善效果與Metoprolol組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)，見圖4。

圖4 TFG對(duì)IHF大鼠心肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響Fig.4 Effects of TFG on endoplasmic reticulum stress-related proteins in myocardial tissues of IHF rats

圖5 TFG對(duì)IHF大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白的影響Fig.5 Effects of TFG on autophagy-related proteins in myocardial tissues of IHF rats

2.5TFG對(duì)IHF大鼠心肌組織中自噬相關(guān)蛋白的影響 與Control組相比，IHF model組大鼠心肌組織Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平顯著上升，p62表達(dá)顯著下降(P<0.05)；與IHF model組相比，TGF組Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平顯著下降，p62表達(dá)顯著上升(P<0.05)，且高劑量組改善效果與Metoprolol組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)，見圖5。

3 討論

銀杏葉作為傳統(tǒng)中藥，具有活血化瘀、通絡(luò)、斂肺平喘、化瘀降脂等功效[9]。TFG是銀杏葉提取物重要有效成分，具有擴(kuò)血管、抗氧化作用，對(duì)心肌缺血大鼠心肌損傷有保護(hù)作用[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)TFG預(yù)處理IHF大鼠可明顯改善其心肌組織損傷，與高子任[12]研究結(jié)果相似。

心臟重塑對(duì)IHF具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)IHF組大鼠術(shù)后4周心臟功能指標(biāo)(LVEF、FS、LVWT、LVESV和LVEDV)出現(xiàn)明顯惡化，提示IHF模型大鼠復(fù)制成功。而TFG預(yù)處理的IHF大鼠心功能明顯改善，提示TFG對(duì)IHF左心重塑具有保護(hù)作用。心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心臟重塑的進(jìn)展至關(guān)重要，Caspase-3是細(xì)胞凋亡通路的主要執(zhí)行者，本研究發(fā)現(xiàn)TFG預(yù)處理可減少IHF大鼠心肌組織Caspase-3表達(dá)，提示TFG可減少IHF大鼠心肌細(xì)胞凋亡，與文獻(xiàn)[13]結(jié)論相符。

ERS參與多種疾病發(fā)生發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)，ERS誘導(dǎo)的過度自噬和凋亡對(duì)心臟重塑起重要作用[14]。ERS涉及多種蛋白，ERS相關(guān)蛋白包括：CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT enhace-binding protein homologous protein，CHOP)、切割后半胱天冬酶12(cleaved Caspase-12)、生長(zhǎng)停滯與DNA損害可誘導(dǎo)蛋白34(growth arrest and DNA damage inducible protein 34，GADD34)、免疫球蛋白結(jié)合蛋白(immunoglobulin binding protein，Bip)；自噬相關(guān)蛋白：Beclin1、p62、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3蛋白(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ。未折疊蛋白積累時(shí)會(huì)導(dǎo)致Bip從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，從而調(diào)控下游ERS蛋白轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致蛋白合成終止，而GADD34可恢復(fù)蛋白質(zhì)翻譯功能。同時(shí)，ERS發(fā)生后細(xì)胞會(huì)表達(dá)凋亡相關(guān)蛋白，抵御ERS造成的不利影響，如核轉(zhuǎn)錄因子CHOP其表達(dá)可激活Caspase-12，引起細(xì)胞凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，TFG預(yù)處理可下調(diào)IHF大鼠心肌組織CHOP、cleaved Caspase-12表達(dá)，并上調(diào)GADD34、Bip表達(dá)，提示TFG可減少ERS對(duì)IHF大鼠心肌細(xì)胞損傷，可能與調(diào)節(jié)CHOP、cleaved Caspase-12、GADD34及Bip水平有關(guān)。自噬是細(xì)胞降解多余細(xì)胞器、蛋白及老化細(xì)胞的過程，羅丹等[16]報(bào)道心肌細(xì)胞的過度自噬參與心臟重塑。LC3是自噬中的關(guān)節(jié)蛋白，其亞型LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3Ⅱ是自噬激活的重要標(biāo)志；Beclin1是一種抑癌基因，其編碼的蛋白可與PI3K形成復(fù)合物調(diào)節(jié)自噬活性，p62是一種泛素結(jié)合蛋白，可與自噬小體上的LC3Ⅱ形成復(fù)合物，其水平可間接反映自噬小體清除水平[17，18]。本研究發(fā)現(xiàn)，TFG可下調(diào)IHF大鼠心肌組織中Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平，上調(diào)p62表達(dá)，提示TFG可減少自噬對(duì)IHF大鼠心肌細(xì)胞損傷，可能與調(diào)節(jié)Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p62水平有關(guān)。

本研究證實(shí)TFG可抑制心肌細(xì)胞過度自噬對(duì)IHF大鼠心肌重塑和ERS進(jìn)行調(diào)節(jié)，且高劑量TFG的作用效果與常規(guī)心力衰竭藥物美托洛爾片相近，可為心力衰竭的臨床用藥提供參考。