miR-19b-3p靶向LRIG1調控喉癌細胞凋亡和放射敏感性分子機制研究

劉磊峰 邱海濤 江 楓 惠明朗 王代紅 莊雙豪 姚 俊

(廣東醫科大學附屬醫院耳鼻咽喉科，湛江 524000)

喉癌是一種呼吸道惡性腫瘤，其發病率僅次于肺癌，但患者5年生存率低于50%。放射治療對喉癌的療效較好，但腫瘤細胞放射抵抗性是導致患者放射治療后復發的重要原因[1]。因而積極探尋喉癌細胞放射抵抗性相關標志物對提高患者治療效果及其生活質量均具有重要現實意義。研究表明微小RNA-19b(microRNA-19b，miR-19b)在非小細胞肺癌組織中高表達，并可參與其發生及發展過程[2]。miR-19b在黑素瘤細胞中表達升高，可能作為黑素瘤治療的潛在靶點[3]。miR-19b-3p在結腸癌組織及細胞系中表達上調，并可促進結腸癌細胞增殖[4]。miR-19b-3p在鼻咽癌中表達上調，miR-19b-3p過表達可降低鼻咽癌細胞的放射敏感性，抑制miR-19b-3p表達可增強鼻咽癌細胞的放射敏感性[5]。但miR-19b-3p在喉癌組織及細胞中的表達及其對喉癌細胞放射敏感性的影響尚未可知。富含亮氨酸重復和免疫球蛋白樣結構域(lecucine-nich repeats animmunoglobulin-like domains-1，LRIG1)在食管癌和胃癌組織中低表達，提示其可能有抑癌作用[6,7]。LRIG1在口腔疣狀癌組織中表達降低，可能通過抑制Bcl-2的表達抑制口腔疣狀癌的發生發展[8]。膠質瘤SHG44細胞中過表達LRIGl基因，可通過下調EGFR表達，抑制sHG44細胞的惡性生物學行為，增加放療敏感性[9]。通過靶基因預測，miR-19b-3p的靶基因可能是LRIG1，但miR-19b-3p是否通過調控LRIG1的表達影響喉癌細胞的凋亡和放射敏感性目前還尚未可知。因此，本研究通過體外觀察miR-19b-3p表達對喉癌細胞凋亡及放射敏感性的影響分析其是否靶向調控LRIG1而發揮作用，為增強喉癌細胞放射敏感性奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞與主要試劑 喉癌Hep2細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。RPMI1640培養基與胎牛血清均購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000轉染試劑、TRIzol試劑、反轉錄試劑盒均購自美國Invitrogen公司；SYBR Green PCR試劑盒購自羅氏公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；LRIG1、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bax)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved-caspase3)抗體均購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG二抗購自美國Santa Cruz公司；miR-19b-3p抑制劑(anti-miR-19b-3p)、miR-19b-3p模擬物(miR-19b-3p mimics)、si-LRIG1及其各自陰性對照均購自上海吉瑪生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；增強化學發光試劑盒購自武漢博士德生物公司。

1.1.2研究對象及一般資料 以2016年2月～2017年12月本院收治的30例喉癌患者為研究對象，所有患者均經臨床病理證實為喉癌，男16例，女14例，年齡為56～75歲，平均為(65.47±3.56)歲，患者均接受手術并于術中切取喉癌組織及癌旁組織，迅速放入液氮中，術后將其轉移至-80℃超低溫冰箱。所有患者術前均未接受放療或化療，本研究經本院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。

1.2方法

1.2.1細胞轉染與分組 喉癌Hep2細胞放入含有10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養基，培養于含有5%CO2的37℃恒溫培養箱，待細胞培養融合度達到80%時轉染。將喉癌Hep2細胞分為anti-miR-19b-3p組(轉染miR-19b-3p抑制劑anti-miR-19b-3p)、anti-miR-NC組(轉染miR-19b-3p的陰性對照)、pcDNA-LRIG1組(轉染LRIG1過表達載體pcDNA-LRIG1)、pcDNA組(轉染LRIG1空載體)、anti-miR-19b-3p+si-LRIG1組(共轉染anti-miR-19b-3p與si-LRIG1)、anti-miR-19b-3p+si-NC組(共轉染anti-miR-19b-3p與si-NC)、miR-19b-3p組(轉染miR-19b-3p mimics)、miR-NC組(轉染miR-19b-3p陰性對照)。轉染后6 h換液，加入含有10%胎牛血清的新鮮完全培養液。置于含有5%CO2的37℃恒溫培養箱繼續培養48 h。anti-miR-19b-3p組、anti-miR-NC組、pcDNA組、pcDNA-LRIG1組、anti-miR-19b-3p+si-NC組 anti-miR-19b-3p+si-LRIG1組分別接受0、2、4、6、8 Gy照射，照射條件為：源皮距100 cm，照射野(35 cm×35 cm)，5 Gy/min劑量率，實驗均重復3次。

1.2.2qRT-PCR檢測喉癌組織及Hep2細胞中miR-19b-3p、LRIG1 mRNA表達 分別收集喉癌組織及各組對數生長期Hep2細胞，采用TRIzol法檢測miR-19b-3p、LRIG1 mRNA表達，反轉錄試劑盒合成cDNA，反轉錄體系20 μl：10×RT Primer 2 μl、10×RT Buffer 2 μl、dNTP Mixtrue 1 μl、Quant KTase 0.5 μl、上、下游引物各1.5 μl RNase-free ddH2O 11.5 μl。miR-19b-3p上游引物為：5′-TGTCATAATCACTGTGCAAATCC-3′，下游引物為：5′-TATGGTTGTTCAGCTCTCTGTCTC-3′，產物120 bp；LRIG1上游引物為5′-AGATCGCCTGGCAGAAAGAC-3′，下游引物為：5′-ACGGTGGTCCTTCATTTCCT-3′。產物460 bp。qRT-PCR反應體系20 μl：2×miRcute miRNA Premix 10 μl、上下游引物各0.4 μl、cDNA 2 μl、RNase-free ddH2O 7.2 μl；反應程序：95℃預變性2 min循環1次；95℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s循環40次。LRIG1以GAPDH為內參基因，miR-19b-3p以U6為內參基因，所有樣本均設置3次重復，以2-ΔΔCt法計算miR-19b-3p、LRIG1 mRNA相對表達量。

1.2.3蛋白免疫印跡(Western blot)檢測喉癌組織及細胞中LRIG1、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3蛋白表達 收集喉癌組織及各組Hep2細胞，預冷PBS洗滌細胞2次×5 min，加入400 μl裂解液(Tris-HCl、NaCl、EDTA、NP-40、PMSF、pepstain A)，加入20 μg 蛋白樣本進行SDS-PAGE電泳，轉膜，加入一抗孵育24 h(1∶400)、加入二抗孵育1 h(1∶1 000)，應用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.4檢測細胞凋亡率 按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，用預冷的PBS洗滌轉染后各組喉癌Hep2細胞，加入100 μl binding緩沖液重懸細胞，調整細胞密度為1×106個/ml，加入5μl Annexin V-FITC(避光孵育15 min，1 000 r/min離心3 min)與5 μl PI(避光孵育15 min)，上機于1 h內流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5克隆形成實驗 收取轉染后各組經不同照射劑量X線照射的喉癌Hep2細胞，用胰蛋白酶消化，收集細胞后置于10 ml EP管，加入RPMI1640培養基重懸細胞，重新計數，稀釋細胞后接種于6孔板，每組每孔分別接種1 000個細胞，每組均設置3個復孔，置于37℃恒溫培養箱培養10～14 d，每隔2 d 更換一次培養液；用無水乙醇固定20 min，加入0.5%結晶紫染色30 min，洗去多余染液，風干后置于顯微鏡下觀察克隆數，細胞克隆形成率=(有效克隆數/接種細胞)×100%，細胞存活分數=(受照射細胞克隆形成率/對照細胞克隆形成率)×100%，同時用細胞存活分數擬合單擊-多靶模型曲線，每組實驗均重復3次。

1.2.6雙熒光素酶報告基因實驗 利用Target Scans靶基因預測軟件篩選出LRIG1可能為miR-19b-3p的靶基因，發現LRIG1的3′非翻譯區(3′UTR)可能是miR-19b-3p的結合位點。將含有miR-19b-3p結合位點的LRIG1 3′UTR序列及其突變體插入熒光素酶報告基因載體中得到WT-LRIG1、MUT-LRIG1，另將喉癌Hep2細胞接種于24孔板，miR-19b-3p mimic或miR-NC分別與WT-LRIG1、MUT-LRIG1共轉染入喉癌Hep2細胞，置于含有5%CO2的37℃恒溫培養箱內繼續培養24 h，收集細胞，細胞裂解后置于室溫下振蕩20 min，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細胞熒光素酶活性。

2 結果

2.1miR-19b-3p和LRIG1在喉癌組織中的表達 miR-19b-3p在喉癌組織中的表達水平較癌旁組織明顯升高(P<0.05)，而LRIG1 mRNA及蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，見圖1。

2.2抑制miR-19b-3p表達對喉癌Hep2細胞凋亡的影響 qRT-PCR實驗驗證轉染anti-miR-19b-3p的轉染效果，結果顯示，anti-miR-19b-3p組喉癌Hep2細胞中miR-19b-3p的表達水平與anti-miR-NC組相比明顯降低(P<0.05)。流式細胞術檢測結果顯示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-19b-3p組喉癌Hep2細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，而Bax、cleaved-caspase3蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)，見圖2。表明抑制miR-19b-3p表達可通過調控細胞凋亡相關蛋白表達進而誘導喉癌細胞凋亡。

2.3抑制miR-19b-3p表達對喉癌Hep2細胞放射敏感性的影響 抑制miR-19b-3p表達后檢測喉癌Hep2細胞存活分數變化，不同劑量(2、4、6、8 Gy)X線照射下，anti-miR-19b-3p組細胞存活率較anti-miR-NC組顯著降低(P<0.05)，單擊-多靶模型分別擬合細胞存活曲線及模型參數，見圖3、表1，anti-miR-19b-3p組喉癌Hep2細胞增敏比(SER)為1.654。表明抑制miR-19b-3p表達可增強喉癌Hep2細胞放射敏感性。

2.4LRIG1過表達對喉癌Hep2細胞凋亡和放射敏感性的影響 Western blot實驗檢測LRIG1過表達(P<0.05)，明顯促進Bax表達(P<0.05)，而抑制Bcl-2表達轉染效果，如圖4A所示，pcDNA-LRIG1組喉癌Hep2細胞中LRIG1的蛋白表達水平較pcDNA組顯著升高(P<0.05)，提示轉染成功。pcDNA-LRIG1組喉癌Hep2細胞凋亡率相較于pcDNA組顯著升高(P<0.05)，進一步用不同劑量X線照射結果顯示，與pcDNA組相比，pcDNA-LRIG1組喉癌Hep2細胞存活分數明顯降低(P<0.05)，細胞增敏比(SER)為1.788，見圖4、表2。表明LRIG1過表達可能通過促進喉癌Hep2細胞凋亡進而增強放射敏感性。

圖1 miR-19b-3p和LRIG1在喉癌組織中的表達Fig.1 Expression of miR-19b-3p and LRIG1 in laryng-eal carcinoma

圖2 抑制miR-19b-3p表達對喉癌Hep2細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of inhibition of miR-19b-3p expression on apoptosis of laryngeal carcinoma Hep2 cells

圖3 抑制miR-19b-3p表達對喉癌Hep2細胞放射敏感性的影響Fig.3 Effect of inhibition of miR-19b-3p expression on radiosensitivity of laryngeal carcinoma Hep2 cells

2.5miR-19b-3p靶向調控LRIG1的表達 TargetScan預測miR-19b-3p靶基因，結果顯示LRIG1可能為miR-19b-3p的功能性靶基因，miR-19b-3p預測結合LRIG1的3′UTR的靶點如圖5A所示。共轉染WT-LRIG1與miR-19b-3p mimics的熒光素酶活性較共轉染WT-LRIG1、miR-NC的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而共轉染MUT-LRIG1與miR-19b-3p mimics的熒光素酶活性與共轉染WT-LRIG1、miR-NC的熒光素酶活性相比無顯著性差異(P>0.05)，見圖5，表明LRIG1是miR-19b-3p的直接靶基因。與miR-NC組相比，miR-19b-3p組喉癌細胞中LRIG1的表達水平顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-19b-3p組喉癌細胞中LRIG1的表達水平顯著升高(P<0.05)。表明miR-19b-3p可負向調控靶基因LRIG1的表達。

表1 抑制miR-19b-3p的表達對Hep-2細胞增敏比及存活分數等相關參數的影響

圖4 LRIG1過表達對喉癌Hep2細胞凋亡和放射敏感性的影響Fig.4 Effect of LRIG1 overexpression on apoptosis and radiosensitivity of laryngeal carcinoma Hep2 cells

表2 LRIG1過表達對喉癌Hep2細胞增敏比及存活分數等相關參數的影響

圖5 miR-19b-3p靶向調控LRIG1的表達Fig.5 miR-19b-3p targeted regulation of LRIG1 expression

表3 抑制miR-19b-3p的表達及沉默LRIG1的表達對Hep-2細胞增敏比及存活分數等相關參數的影響

圖6 抑制LRIG1表達逆轉了抑制miR-19b-3p表達對喉癌Hep2細胞凋亡和放射敏感性的作用Fig.6 Inhibition of LRIG1 expression reverses effect of inhibition of miR-19b-3p expression on apoptosis and radiosensitivity of laryngeal carcinoma Hep2 cells

2.6抑制LRIG1表達逆轉了抑制miR-19b-3p表達對喉癌Hep2細胞凋亡和放射敏感性的作用 與anti-miR-19b-3p+si-NC組相比，anti-miR-19b-3p+si-LRIG1組喉癌Hep2細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達上調(P<0.05)，而Bax蛋白表達下調(P<0.05)，細胞存活分數明顯升高(P<0.05)，細胞增敏比(SER)為0.668，見圖6、表3。表明抑制LRIG1表達可恢復抑制miR-19b-3p表達對喉癌Hep2細胞凋亡的抑制作用及其增強細胞放射敏感性的作用。

3 討論

喉癌放射敏感性與腫瘤細胞中癌基因或抑癌基因異常表達及其相關分子生物學機制有關[10,11]。可通過上調或下調miRNA表達增加喉癌細胞凋亡并增強放射敏感性[12]。但miRNA與喉癌放射敏感性的相關性研究相對較少，因此需進一步探討miRNA對喉癌細胞放射敏感性的影響及其內在分子機制。

miR-19b-3p在胃癌、前列腺癌等惡性腫瘤中均呈高表達，其可能作為腫瘤早期診斷及評估患者預后的潛在生物標志物[13,14]。Wei等[15]研究表明，苦參堿可通過調控miR-19b-3p/PTEN軸進而抑制黑素瘤發生及發展進程。Jin等[16]研究表明下調miR-19b-3p可通過調節PI3K/Akt通路抑制乳腺癌細胞增殖并逆轉塞卡替尼的抗性。本研究檢測喉癌組織、癌旁組織及Hep2細胞中miR-19b-3p的表達，結果發現miR-19b-3p的表達水平均顯著升高，體外培養Hep2細胞并轉染入anti-miR-19b-3p而抑制其表達，進一步觀察細胞凋亡情況，結果發現抑制miR-19b-3p表達后可明顯促進喉癌細胞凋亡，并可促進Bax、cleaved-caspase3表達及抑制Bcl-2表達，已有研究報道指出Bcl-2屬于抗凋亡基因，Bax屬于凋亡基因，Bcl-2可通過調控線粒體凋亡通路激活caspase3級聯反應進而促進細胞凋亡[17,18]。提示下調miR-19b-3p表達可通過調控細胞凋亡相關蛋白進而促進喉癌細胞凋亡。用不同劑量X線照射喉癌細胞結果發現，抑制miR-19b-3p表達后喉癌細胞存活分數顯著降低，增敏比明顯升高，提示抑制miR-19b-3p表達可顯著增強喉癌細胞放射敏感性。

LRIG1可維持組織及細胞的結構和功能，其在多種腫瘤發生發展過程中均呈低表達，并可發揮抑癌基因作用[19]。沉默LRIG1可抑制卵巢癌細胞凋亡并降低細胞對藥物的敏感性[20]。朱曉楠等[21]研究表明，上調LRIG1表達后可通過抑制RAD51蛋白表達而抑制雙鏈DNA損傷修復進而增強人腦膠質瘤細胞放射敏感性。嚴澤軍等[22]研究表明LRIG1可通過下調EGFR表達進而促進膀胱癌細胞凋亡并提高細胞對順鉑的敏感性。相關研究表明LRIG1過表達可通過下調靶基因EGFR表達逆轉上皮-間質(EMT)轉化進程，抑制腦膠質瘤細胞惡性生物學行為進而增強其放射敏感性[23]。與上述研究報道相似，本研究結果發現喉癌組織及細胞系中LRIG1的mRNA及蛋白表達水平均顯著降低，通過上調LRIG1表達后發現喉癌細胞凋亡率顯著升高，而細胞存活分數顯著降低，提示LRIG1過表達可誘導喉癌細胞凋亡并增強其放射敏感性。通過生物學信息網站預測LRIG1可能為miR-19b-3p的靶基因，采用雙熒光素酶報告基因實驗驗證LRIG1是miR-19b-3p的靶基因，進一步分析發現miR-19b-3p可負向調控靶基因LRIG1的表達，為探究miR-19b-3p是否可通過調控靶基因LRIG1表達進而參與喉癌細胞凋亡及放射抵抗性過程，本研究將anti-miR-19b-3p與si-LRIG1共轉染入喉癌細胞，結果發現細胞凋亡率顯著降低，細胞存活分數顯著升高，細胞增敏比顯著降低，提示下調miR-19b-3p表達可通過調控LRIG1進而誘導喉癌細胞凋亡并增強細胞放射敏感性。

綜上所述，喉癌中miR-19b-3p、LRIG1表達異常與放射敏感性有關，靶向下調miR-19b-3p表達可上調靶基因LRIG1表達進而提高喉癌放射敏感性，其可能作為喉癌放療的治療靶點及判斷放射敏感性的分子標志物。但關于其是否可在臨床實踐中廣泛應用仍需臨床實驗證實。