抑制微小染色體支持蛋白2的表達(dá)可增強(qiáng)卵巢癌對(duì)卡鉑的敏感性

王書(shū)博，譚文華

(1.威海市婦女兒童醫(yī)院，山東 威海 264200；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150078)

卵巢癌是目前女性生殖系統(tǒng)腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤。據(jù)報(bào)道，2017年，世界上有22 240位女性罹患卵巢癌，14 080 例患者死于卵巢癌[1]。盡管檢測(cè)技術(shù)及治療手段不斷更新，但晚期卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療耐藥等因素導(dǎo)致的卵巢癌死亡率逐年增加。化療耐藥是當(dāng)前治療卵巢癌遇到的主要挑戰(zhàn)，其耐藥機(jī)制尚未完全明確。微小染色體支持蛋白2(MCM2)對(duì)調(diào)節(jié)DNA復(fù)制極為重要。在細(xì)胞周期的G1期，復(fù)制起點(diǎn)復(fù)合體誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，DNA復(fù)制因子1和MCM2組成了復(fù)制前復(fù)合物，為DNA復(fù)制做準(zhǔn)備[2-3]。在細(xì)胞分裂S期，細(xì)胞周期激酶激活MCM2復(fù)合物，細(xì)胞開(kāi)始復(fù)制。既往研究表明酵母的MCM2基因突變可導(dǎo)致染色體缺失、DNA破壞及基因重組[4]。有研究表明，MCM2表達(dá)下降可導(dǎo)致大鼠患淋巴瘤[5]。大量研究表明MCM2可促使癌細(xì)胞增殖，且可作為胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌判斷預(yù)后的重要標(biāo)志物，比起傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物如Ki67敏感性更高[6]。曾有研究報(bào)道，在高度惡性的腫瘤細(xì)胞中MCM2的表達(dá)要遠(yuǎn)高于低度惡性的癌細(xì)胞，且MCM2高表達(dá)與腫瘤分期晚、預(yù)后差明顯相關(guān)[7]。本文旨在研究降低MCM2的表達(dá)是否可以增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)卡鉑的敏感性，從而延長(zhǎng)患者的無(wú)進(jìn)展生存期。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)用的卡鉑注射液購(gòu)于山東威海婦女兒童醫(yī)院，A2780卵巢癌細(xì)胞株及239T細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)研究委員會(huì)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

A2780卵巢癌細(xì)胞株被置于含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素溶液的培養(yǎng)基中；239T細(xì)胞被置于DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，孵育溫度為37 ℃。

1.2.2 免疫印跡試驗(yàn)

應(yīng)用免疫印跡試驗(yàn)(western blot)檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)，采用不同一抗封閉細(xì)胞膜蛋白，接著用辣根過(guò)氧化物酶二抗進(jìn)行孵育。使用化學(xué)成像發(fā)光儀觀察免疫反應(yīng)帶。

1.2.3 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整濃度為每孔1×103個(gè)，將細(xì)胞種植于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后加藥，3.5% CO2，37 ℃孵育2 h。每孔中加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)1～4 h，取出96孔板，將其置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上，振蕩15 s，然后在450 nm下測(cè)量吸光，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 細(xì)胞周期試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按4×105個(gè)/mL，以1 mL接種24孔板或2 mL接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)16～24 h。800 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，棄上清，用預(yù)冷PBS洗滌兩次，加入預(yù)冷75%乙醇，于4 ℃固定4 h以上。1 500 r/min離心5 min，棄上清，以3 mL的PBS洗滌一次，加入400 μL溴化乙啶(PI，50 μg/mL)，100 μL RNase A(100 μg/mL)，4 ℃避光孵育30 min。用流式細(xì)胞儀以標(biāo)準(zhǔn)程序檢測(cè)，一般計(jì)數(shù)2～3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。

1.2.5 集落形成試驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，采用常規(guī)消化傳代方法，制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分分散，單個(gè)細(xì)胞百分率應(yīng)在95%以上。根據(jù)細(xì)胞增殖能力，將細(xì)胞懸液倍比稀釋。一般按照每皿含50，100，200個(gè)細(xì)胞的濃度分別接種于5 mL細(xì)胞懸液到培養(yǎng)皿(直徑60 mm)中，以十字方向輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻。培養(yǎng)皿置37 ℃，5%CO2中培養(yǎng)2～3周，中間根據(jù)培養(yǎng)液pH變化適時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS小心浸洗2次，空氣干燥。甲醇固定15 min，棄甲醇后空氣干燥。用Giemsa染液染色10 min，流水緩慢洗去染液，空氣干燥。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的人卵巢癌A2780細(xì)胞株

為了研究卵巢癌細(xì)胞中MCM2的表達(dá)，使用shRNA(短卡RNA)轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株中的MCM2 (shMCM2-1 and shMCM2-2)作為實(shí)驗(yàn)組，無(wú)shRNA轉(zhuǎn)染的MCM2(shCON)作為對(duì)照組。使用western blot法檢測(cè)A2780卵巢癌細(xì)胞株中MCM2的表達(dá)。與對(duì)照組相比，shMCM2-1及shMCM2-2蛋白表達(dá)分別下降了(50.6±4.0)%和(49.1±3.6)%(見(jiàn)圖1)。

shMCM2-1，shMCM2-2為shRNA轉(zhuǎn)染的MCM的表達(dá)，無(wú)shRNA轉(zhuǎn)染的MCM2(shCON)作為對(duì)照組

圖1Western blot法檢測(cè)卵巢癌A2780細(xì)胞株中的MCM2的表達(dá)

2.2 下調(diào)MCM2的表達(dá)對(duì)A2780卵巢癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，下調(diào)MCM2的表達(dá)明顯抑制A2780卵巢癌細(xì)胞株的增殖(見(jiàn)圖2)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCM2對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，在4～5天時(shí)卵巢癌細(xì)胞增殖明顯受到抑制。由圖3可知shRNA轉(zhuǎn)染的MCM2細(xì)胞中G1及G2期細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。研究結(jié)果表明抑制MCM2的表達(dá)可增加G1期卵巢癌細(xì)胞數(shù)量，減少G2期卵巢癌細(xì)胞數(shù)量。

圖2 shRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后MCM2的表達(dá)情況

圖3 流式細(xì)胞儀對(duì)不同細(xì)胞周期卵巢癌細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)

2.3 下調(diào)MCM2的表達(dá)可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)卡鉑的敏感性

使用集落形成試驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)MCM2的表達(dá)是否可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)卡鉑化療的敏感性。對(duì)照組細(xì)胞及MCM2表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞均使用不同濃度的卡鉑注射液進(jìn)行處理。結(jié)果表明，使用不同濃度卡鉑溶液(0，2.5，3.5，5.0和7.5 μg/mL)處理后的shMCM2及對(duì)照組MCM2集落形成數(shù)量明顯減少(見(jiàn)圖4)。

圖4 使用不同濃度卡鉑溶液處理后的shMCM2及對(duì)照組MCM2集落形成數(shù)量

3 討 論

以卡鉑為基礎(chǔ)的化療是治療進(jìn)展期卵巢癌標(biāo)準(zhǔn)的一線治療方案，但化療耐藥是導(dǎo)致治療失敗的主要原因，所以逆轉(zhuǎn)卡鉑耐藥是多學(xué)科治療卵巢癌的焦點(diǎn)問(wèn)題[8]。過(guò)去的研究表明順鉑耐藥后的卵巢癌細(xì)胞株P(guān)E01CDDP中MCM2的表達(dá)比正常的PE01細(xì)胞中高兩倍，因此研究人員推測(cè)MCM2可能與卵巢癌患者的化療耐藥有關(guān)[9]。微小染色體蛋白家族是DNA復(fù)制啟動(dòng)區(qū)域的重要因子，其在細(xì)胞分裂周期G1期與DNA結(jié)合，在S期被激活，參與DNA復(fù)制。據(jù)報(bào)道，MCM2/5活性區(qū)域作為ATP依賴的門戶發(fā)揮作用，在各種類型的癌細(xì)胞中MCM2的表達(dá)顯著增加，且被認(rèn)為與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后差有關(guān)[10]。此外，MCM2表達(dá)增加與一項(xiàng)重要的細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67升高有關(guān)。過(guò)去的研究表明MCM2的表達(dá)對(duì)于維持染色體穩(wěn)定性至關(guān)重要[7]。因此，本文旨在研究A2780卵巢癌細(xì)胞株中的MCM2表達(dá)下調(diào)對(duì)DNA復(fù)制的影響。目前的研究表明MCM2表達(dá)下調(diào)影響細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期，并未影響細(xì)胞凋亡[3]。研究資料表明A2780卵巢癌細(xì)胞株在接受卡鉑化療后，通過(guò)抑制MCM2的表達(dá)可提高其對(duì)卡鉑的敏感性，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。在有限的DNA復(fù)制條件下，細(xì)胞可能會(huì)需要更多的復(fù)制起始點(diǎn)來(lái)修復(fù)已被破壞的復(fù)制叉。這種假說(shuō)可能是MCM2下調(diào)抑制DNA復(fù)制的原因。潛在大量的DNA復(fù)制起始點(diǎn)不僅能修復(fù)被破壞的DNA復(fù)制叉，同時(shí)對(duì)于維持染色體的穩(wěn)定性至關(guān)重要，故下調(diào)MCM2的表達(dá)水平可大幅增加大鼠患癌癥的概率[11]。此外，過(guò)去的研究表明DNA復(fù)制起始點(diǎn)的增加可以減少基因受損的概率[12-13]。

本研究表明下調(diào)MCM2的表達(dá)水平可增強(qiáng)A2780卵巢癌細(xì)胞株對(duì)卡鉑化療的敏感性，因此下調(diào)MCM2聯(lián)合卡鉑化療會(huì)有效克服卵巢癌細(xì)胞的化療耐藥性，為進(jìn)展期卵巢癌的治療提供參考和新思路。