胃腸道間質瘤組織中Gli-1、p-AKT、p-ERK的表達及意義

祁義軍 趙文娣 王正林 楊書瀚 汪正廣

轉錄因子Gli（Glioma-associated Oncogene homoglog）是Shh通路的重要組成部分，也是Shh信號通路的靶基因[1]。阻斷腫瘤細胞中的Shh信號轉導通路某個節(jié)點，有可能為腫瘤的靶向治療提供一個新的途徑[2]。前期的研究[3]我們發(fā)現GIST中有Shh信號通路的存在，且與GIST的發(fā)生發(fā)展密切相關，但具體機制不清。PI3K信號通路和MAPK信號通路是目前已被證明與GIST關系密切的信號通路[4]，為探討Shh信號通路在GIST中是否與PI3K和MAPK信號通路有關聯，我們用Western方法檢測了我院一年間手術的GIST患者標本，并分析其相互間的關系。

1 資料與方法

1.1 標本與試劑

1.1.1 標本 145例標本選自2013年1月-12月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院行手術治療的GIST患者，臨床資料完整。術前均未接受其他治療（如化療或放療）。標本處理：中性福爾馬林（10%）固定后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片（4μm），HE染色。病理診斷由兩位病理醫(yī)師閱片共同診斷核實。

1.1.2 試劑 主要試劑來源：Anti-Tubulin Ab購自Sigma，p-AKT Ab 、p-ERK1/2 Ab購自Cell Signaling，Anti-AKT Ab和Anti-ERK1/2 Ab購自BioWorld，Anti-Gli-1Ab購自Santa Cruz。

1.2 方法

1.2.1 石蠟組織提取蛋白 ①取厚約10～15 um的石蠟切片兩塊，取100 mm2石蠟組織切片放入離心管，加入預處理試劑A1 mL，30 s高速渦懸震蕩后再5 min室溫靜置；加入100 uL預處理試劑B，渦懸震蕩（10 s）后離心。②脫蠟組織清洗兩次后保留的組織塊予以沉淀；加入提取試劑100 uL，震蕩后予20 min 100 ℃加熱，離心后切片組織用組織研磨棒磨碎。③2 h 60 ℃加熱后離心15 min（4 ℃，12000 rpm)，加入沉淀試劑1 mL，震蕩后4 ℃靜置10 min；15 min離心(4 ℃，12000 rpm)，去上清液留沉淀。④加入沉淀試劑0.5 mL加入后10 s震蕩，靜置10 min 4 ℃后離心15 min（4 ℃，12000 rpm）。⑤僅保留沉淀，離心管倒置濾紙上（通風櫥中），使殘余液體揮發(fā)完全；組織裂解液溶解固體沉淀，15 min沸水浴，10 min離心（4 ℃，12000 rpm），收集上清液后上樣分析。

1.2.2 免疫印跡 ①垂直電泳：采用SDS-PAGE凝膠垂直電泳，同時使用蛋白質預染Marker，電壓設定：濃縮膠電泳電壓恒壓80 V；分離膠電泳電壓恒壓120 V。②轉膜：取厚濾紙兩張，PVDF膜一張，大小90 mm×70 mm，PVDF膜在甲醇中潤濕后，再同濾紙一起浸透于轉移緩沖液。放置于轉膜夾上的順序（由上而下）為海綿、濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙、海綿。轉膜時電壓：恒流220 mA，時間1.5～2 h。③封閉：待轉膜完成后取出PVDF膜，置10 mL含有5%BSA的1×TBST封閉液，將其在60 rpm/min的水平搖床上封閉1 h（室溫）。④一抗：5%BSA的1×TBST配制非標記抗體，PVDF膜（封閉后的）放入一抗中，1 h室溫孵育后洗膜3次。⑤二抗：HRP酶標二抗用含5%BSA的1×TBST配制，放入二抗后1 h室溫孵育，洗膜3次。⑥顯影：PVDF膜上均勻涂布MilliPore顯影液（A液與B液按1:1混勻），吸干顯色液（反應1 min后），X光片曝光，顯影用顯影液及定影液，顯影好的X光片晾干。

1.3 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計學處理采用SPSS（16.0 for window）軟件，根據資料性質分別采用卡方檢驗各蛋白表達與臨床參數間關系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義；Pearson分析各蛋白表達相關性。

2 結 果

2.1 臨床病例資料 145例GIST患者中，男80例（55.2%），女65例（44.8%），年齡18～84歲，平均年齡（60.52±11.42）歲，中位年齡62歲。其中胃間質瘤84例（57.9%），小腸間質瘤32例（22.1%），結直腸間質瘤6例（4.1%），食管間質瘤2例（1.4%），胃腸外間質瘤21例（14.5%）。①腫瘤大小：最大直徑≤2.0 cm者35例（24.1%），2.1～5.0 cm者48例（33.1%），5.1～10.0 cm者37例（25.5%），＞10.1 cm者25例（17.2%）。②NIH危險度分級：極低危險度26例（17.9%）；低度危險度41例（28.3%）；中度危險度30例（20.7%）；高度危險度48例（33.1%）。見表1。

2.2 Western-blot檢測不同危險程度GIST中Gli1、p-AKT和p-ERK的表達 如圖1所示：Western blot檢 測 不 同 危 險 程 度GIST中Gli-1、p-AKT、p-ERK的表達，GelDoc測量Gli-1與Tubulin、p-AKT與AKT、p-ERK與ERK的灰度相對比值，結果顯示：在不同危險程度GIST組織中，其Gli-1與 Tubulin、p-AKT與AKT、p-ERK與ERK的灰度相對比值與危險程度分級呈正相關，隨著危險等級的升高，Gli-1、p-AKT、p-ERK的表達也上升，且升高具有一致性（相關系數0＜r＜1，P＜0.01）。

圖1 Western Blot檢測不同危險程度GIST中Gli-1、p-AKT、p-ERK的表達

3 討 論

脊椎動物中，Shh信號通路包括了Hh配體、Patched（Ptch）受體、G蛋白偶聯的磷酸化受體（Smo）、核轉錄因子Gli四個部分。Zhao C等[5]研究發(fā)現抑制Shh信號通路時，可降低野生型BCR-ABL1的慢性粒細胞白血病（CML)的傳播，且可降低伊馬替尼耐藥的CML腫瘤細胞的生長。伊馬替尼也是治療GIST的一線藥物，因而Shh信號通路是否在伊馬替尼耐藥的GIST治療中起作用引起研究者的興趣。我們前期研究[4]已經發(fā)現GIST中有Shh信號通路的存在，且與GIST的發(fā)生發(fā)展密切相關，但具體機制不清。

PI3K主要由催化亞單位P110和調節(jié)亞單位P85構成。細胞膜上的相應受體接受細胞外信號刺激后使PI3K活化，生成的PI-3，4，5-P3即作為第二信使，進一步通過磷酸化而活化其下游的Akt蛋白。PI3K/Akt信號能促進腫瘤壞死因子（TNF）誘導的內皮細胞遷移，調節(jié)腫瘤血管生成進而促進腫瘤生長和轉移。本實驗發(fā)現，PI3K/Akt信號通路在GIST中有表達，且隨著GIST危險度分級的升高，PI3K/Akt表達逐漸上調，表明PI3K/Akt信號通路參與了GIST的發(fā)生發(fā)展過程。

目前發(fā)現MAPK信號通路共有8個亞家族，最早被發(fā)現和目前了解最多的是成員亞族ERK。ERK1/2作為重要傳遞者將信號從細胞膜外傳遞到細胞內，ERK1/2活化以后可以進入細胞核，促進重要轉錄因子的磷酸化，進而參與細胞的增殖、分化和凋亡等。我們的研究雖發(fā)現MAPK信號通路在GIST的發(fā)生發(fā)展中起作用，但是其具體作用機制目前報道仍較少。本組資料中，MAPK信號通路中ERK在所有不同危險度組均有不同程度的表達，表明ERK可能參與了GIST的發(fā)生、發(fā)展過程。王春萌等[6]報道MAPK通道蛋白在GIST中均有陽性表達，其表達在GIST耐藥標本及藥物敏感標本間無區(qū)別（該組資料對8例GIST患者進行檢測），因此仍需多中心大樣本的研究。

細胞信號傳導通路是一個復雜的網絡系統(tǒng)，不同的信號通路間可有交叉調控。本研究發(fā)現GIST中PI3K/Akt信號通路、MAPK/ERK信號通路和Shh信號通路均有表達，表明上述三條信號通路均參與了GIST的發(fā)生發(fā)展過程。其表達的強度密切相關，具有高度一致性，表明上述三條通路在GIST中可能具有交叉聯系。由此推測：Shh信號通路在GIST的發(fā)生發(fā)展中起作用，通過與業(yè)已被證明在其中起重要作用的PI3K/Akt信號通路和MAPK/ERK信號通路之間的交叉聯系可能是其機制之一。此發(fā)現將為尋找治療GIST 的新靶點提供理論依據。