G蛋白偶聯雌激素受體可通過抑制氧化應激反應減輕腎缺血再灌注損傷

章林明許珍珍常越辰司軍強馬克濤李 麗王勤章李應龍

(1.石河子大學醫學院,新疆石河子 832000;2.石河子大學醫學院第一附屬醫院,新疆石河子 832000;3.成都市第五人民醫院,成都 610000)

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性Sprague Dawley(SD)大鼠40只,8～12周齡,體重220～280 g,來源于新疆醫科大學實驗動物中心[SCXK(新)2018-0001],動物房內溫度為20℃～25℃,濕度為50%～55%,給予標準飼料,自由進食水,周圍環境安靜。動物手術在屏障動物實驗設施內進行[SCXK(新)2018-0003]。動物實驗方案經石河子大學醫學院動物管理與使用委員會(IACUC)批準(A2046-047-02)。所有大鼠進行去勢術后(正常雌性大鼠體內的內源性雌激素也可也以激活GPER,故將所有雌性大鼠去卵巢14 d后進行實驗,以排除內源性雌激素對實驗的干擾),按照隨機數字表法分為去卵巢組(OVX組)、缺血再灌注損傷組(OVX+I/R組)、E2干預組(OVX+I/R+E2組)、GPER特異性激動劑G1干預組(OVX+I/R+G1組)、雌激素+GPER特異性阻斷劑 G15干預組(OVX+I/R+G15+E2組),每組8只。

1.2 主要試劑與儀器

17β-雌二醇(Sigma,美國);GPER受體特異性激動劑G1、GPER受體特異性阻斷劑G15(ApexBio,美國);鼠抗p-Akt抗體、兔抗Akt抗體(Proteintech,中國);兔抗 p-PI3K抗體、鼠抗 PI3K抗體(Cell Signaling Technology,美國);鼠抗 β-actin抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司);大鼠雌激素ELISA試劑盒(上海語純生物科技有限公司);SOD檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);蛋白電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 OVX模型及腎缺血再灌注模型的建立

大鼠給予戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后,沿大鼠兩側肋中線備皮,在備皮區域的雙側背部取切口,切口位于肋骨下方約一橫指處,切開皮膚后,鈍性分離皮下筋膜,并延肌肉邊緣分離開肌肉,進入腹腔后,尋找脂肪組織并將其取出,其中粉紅色多囊泡組織即為大鼠卵巢。將卵巢切除,消毒之后對大鼠筋膜、肌肉以及切口進行縫合。將大鼠置于37.5℃的恒溫手術臺上,待大鼠麻醉復蘇后,將其放回已預先消毒完畢的鼠籠中進行飼養。兩周后所有大鼠術前12 h禁食,自由飲水,用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉成功后,切除右腎,用無創動脈夾夾閉左腎腎蒂造成缺血,持續45 min后,松開動脈夾再灌注24 h。E2干預組于術前1 h皮下注射E2(100μg/kg),G1干預組于術前1 h腹腔注射GPER受體激動劑G1(100μg/kg),G15+E2干預組于術前1.5 h腹腔注射G15(300μg/kg),30 min后皮下注射E2(100μg/kg)[17-18]。

1.3.2 血清雌激素水平檢測

將大鼠全血置于室溫下靜置30 min后,離心：3000 r/min,時間10 min,取上清液,使用ELISA試劑盒按說明書檢測各組大鼠E2水平。

1.3.3 腎功能損傷指標檢測

大鼠再灌注24 h后,戊巴比妥鈉腹腔麻醉,行腹主動脈采血,4000 r/min離心10 min,采用美國Roche Cobas Integra 800全自動血生化分析儀檢測血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平。

目前，我們在學校教育方面，也存在許多不完善的地方。一些學校為追求升學率，忽視了對青少年的青春期教育。一些學校對成績好的同學呵護有加，而對成績差的學生則放任自流。有的學校甚至對差生采取“停課”或“開除”等措施。不少學生流入社會后，成了“問題少年”。

1.3.4 腎組織病理檢查

大鼠再灌注24 h后,戊巴比妥鈉腹腔麻醉,左側腎行原位灌流去除血細胞,切取左腎一半置于-80℃保存備用,另一半置于10%中性福爾馬林液中固定,常規石蠟切片和HE染色,×400光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理形態的改變,并進行Paller評分[20]。評分標準如下：腎小管明顯擴張計1分;腎小管上皮細胞扁平或腫脹計1分;刷狀緣損傷計1分;刷狀緣脫落計2分;管型計2分;腎小管管腔內有脫落、壞死(未形成管型或細胞碎屑)計1分;腎小管正常計0分。每個視野下隨機選取10個腎小管進行評分,并根據評分結果,評價腎小管損傷程度。

1.3.5 腎組織氧化應激指標檢測

從-80℃冰箱中取出預存的腎組織,制成10%組織勻漿,離心：4℃ 3000 r/min,10 min,采用 BCA法測蛋白濃度后,嚴格遵循SOD試劑盒及MDA試劑盒的說明書進行腎組織SOD活性及MDA含量的檢測。

1.3.6 Western blot法檢測 p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達

取凍存的腎組織,加入適量預冷的蛋白裂解液制成組織勻漿,離心后取上清,用BCA試劑盒檢測蛋白濃度,配平蛋白濃度,煮沸10 min使蛋白變性,各組取樣50μg蛋白加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。轉膜、封閉后,加入一抗4℃過夜;TBST中洗3次,每次5 min;加入二抗室溫孵育2 h。暗室曝光。用Image J分析軟件檢測條帶灰度值。以βactin為內參照。

1.4 統計學方法

運用SPSS 24.0統計軟件進行統計學分析,計量資料以平均數±標準差(±s)表示,兩組間均數比較采用t檢驗,組間兩兩比較采用LSD法,若方差齊性則組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清雌激素水平檢測結果

如表1和圖1所示,正常SD大鼠OVX術后2周,采用 ELISA法測定雌激素水平。結果表明,OVX組大鼠雌激素水平明顯低于正常大鼠。

2.2 腎功能損傷指標檢測結果

如表2和圖2所示,與OVX組相比,OVX+I/R組大鼠BUN和Cr水平明顯升高,提示OVX+I/R組大鼠腎功能受損,模型制備成功。與OVX+I/R組相比,E2干預組與G1干預組Cr和BUN水平明顯下降;與E2干預組相比,G15+E2干預組Cr和BUN水平明顯升高。

2.3 腎組織病理學改變

如圖3所示,HE染色后光鏡下腎組織病理學改變：OVX組腎小球、腎小管結構正常,間質無充血水腫,無炎性細胞浸潤(圖3A);OVX+I/R組腎小管則明顯擴張,細胞有不同程度的腫脹甚至壞死以及脫落,腎間質水腫,炎性細胞浸潤明顯(圖3B);E2組和G1組大鼠腎小管輕度擴張,上皮細胞腫脹較輕微,壞死較少,炎性細胞浸潤程度明顯減輕(圖3C、3D);E2+G15組腎小管結構不清,部分上皮細胞出現壞死以及脫落(圖3E)。Paller評分結果示表3和圖4所示。

2.4 腎組織氧化應激指標檢測結果

如表4和圖5所示,與對照組相比,IR組大鼠腎組織SOD活性顯著降低(P＜0.01),MDA含量明顯升高(P＜0.01);與IR組相比,E2和G1干預組大鼠腎組織SOD活性顯著升高(P＜0.01),MDA含量明顯下降(P＜0.01);而G15+E2組腎組織SOD活性較E2組降低(P＜0.05),MDA含量較E2組明顯上升(P＜0.01)。

表1 正常大鼠與OVX術后2周大鼠血清雌激素水平(n=8)Table 1 Serum estrogen levels in normal rats and 2 weeks after OVX rats

圖1 正常大鼠與OVX術后2周大鼠血清雌激素水平Note.Compared with Normal group,**P＜0.01.Figure 1 Serum estrogen levels in normal rats and 2 weeks after OVX rats

表2 各組大鼠BUN和Cr的水平(n=8)Table 2 The levels of BUN and Cr in rats from each group

圖2 各組大鼠BUN(A)和Cr(B)的水平Note.A,OVX group.B,OVX+I/R group.C,OVX+I/R+E2 group.D,OVX+I/R+G1 group.E,OVX+I/R+G15+E2 group.Compared with OVX group,**P＜0.01.Compared with OVX+I/R group,##P＜0.01,#P＜0.05.Compared with OVX+I/R+E2 group,&&P＜0.01,&P＜0.05.The same as below.Figure 2 The levels of BUN(A)and Cr(B)in rats from each group

圖3 各組大鼠腎組織病理學改變(HE染色)Note.A,OVX group.B,OVX+I/R group.C,OVX+I/R+E2 group.D,OVX+I/R+G1 group.E,OVX+I/R+G15+E2 group.Figure 3 Histopathological examination of the renal tissue in rats from each group(HE staining)

表3 各組大鼠腎組織Paller評分(n=8)Table 3 Paller score of the renal tissue in rats from each group

圖4 各組大鼠腎組織Paller評分Figure 4 Paller score of the renal tissue in rats from each group

表4 各組大鼠腎組織SOD活性及MDA含量(n=8)Table 4 SOD activity and MDA content of the renal tissue in rats from each group

圖5 各組大鼠腎組織SOD活性及MDA含量Figure 5 SOD activity and MDA content of the renal tissue in rats from each group

2.5 Western blot法分析PI3K/Akt通路的激活情況

如圖6,Western blot結果顯示,與OVX組相比,I/R組腎組織中p-PI3K和p-Akt的表達明顯降低(P＜0.01);與I/R組相比,E2和G1干預組p-PI3K和p-Akt的表達明顯升高(P＜0.01);E2干預組與G1干預組差異無統計學意義;G15+E2干預組與E2干預組相比,p-PI3K和p-Akt表達明顯降低(P＜0.05)。

3 討論

腎缺血再灌注損傷這一病理生理進程在臨床中較為常見,由于腎血供豐富,其對缺血再灌注損傷也極為敏感,故I/R損傷可誘發急性腎功能衰竭(AKI)[21]。目前對I/R損傷的防治主要通過缺血缺氧預適應及藥物預處理等。國內外研究已證實雌激素對腦、心及腎等臟器缺血再灌注損傷具有一定保護作用,然而在臨床上,由于其為性激素,長期用藥會導致一系列嚴重副作用,故其應用受到了極大限制[22]。若腎I/R損傷后激活GPER受體能發揮腎保護作用,則可使用GPER特異性激動劑G1防治腎I/R損傷,從而避免雌激素帶來的一系列問題。本研究結果顯示,大鼠腎缺血再灌注損傷后,血清肌酐和尿素氮明顯升高,E2干預組和G1干預組均有所下降,而E2+G15干預組血肌酐和尿素氮水平較E2干預組升高,表明E2和G1均可減輕腎缺血再灌注損傷,且特異性阻斷GPER后,E2的保護作用明顯減弱。形態學結果顯示,I/R組大鼠腎小管擴張明顯,刷狀緣脫落嚴重,腎小管上皮細胞有不同程度的腫脹、壞死和脫落,腎間質水腫,E2干預組和G1干預組腎小管上皮細胞腫脹和壞死均較少,而E2+G15干預組部分逆轉了E2的保護作用,該結果進一步表明E2減輕腎缺血再灌注損傷可能通過GPER介導。

既往研究發現,GPER可以介導17β-雌二醇的抗氧化應激反應,從而改善冠狀血管反應性[23]。Wang等人[24]發現雌激素的心臟保護作用是GPER介導的,且敲除小鼠GPER基因后,氧化應激反應加重,導致左心室增大,左心功能下降。氧化應激反應是腎I/R損傷的關鍵環節,正常生理條件下,細胞可產生少量ROS,但機體的活性酶(超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、谷胱甘肽GSH等)可以清除ROS,使ROS的產生與清除保持動態平衡,當機體發生缺血再灌注損傷時,產生的ROS明顯增多,超出機體清除ROS的能力,機體內SOD及CAT等抗氧化酶活力下降,便發生氧化應激反應,引起組織細胞損傷。由于SOD是體內重要的抗氧化酶和氧自由基清除劑,而丙二醛(MDA)是氧化應激反應的最終產物,SOD活性和MDA含量被作為監測氧化應激反應的兩個代表性指標[25]。本研究中,通過檢測腎組織SOD活性及MDA含量發現,大鼠腎缺血再灌注損傷后,腎組織SOD活性明顯下降,而MDA含量明顯升高,提示I/R后腎組織氧化應激反應加重,機體自身的氧自由基清除機制不能完全清除過氧化反應的產物。E2干預組和G1干預組明顯逆轉了腎組織SOD活性及MDA含量,提示E2和G1可以通過加強機體氧自由基清除作用,減輕氧化應激反應。而E2+G15干預組較E2干預組SOD活性和MDA含量有所下降,表明雌激素減輕氧化應激反應可能主要通過激活GPER來實現。

圖6 各組大鼠腎組織p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值的比較Figure 6 The p-PI3K/PI3K ratio and p-Akt/Akt ratio of the renal tissue in rats from each group

有研究表明,PI3K/Akt信號通路激活可以調節機體氧化應激反應,Zhu等人[26]研究發現,CTS通過激活PI3K/Akt信號通路,減輕氧化應激反應和細胞凋亡,保護腎缺血再灌注損傷。此外,G1與GPER結合后也可激活 PI3K/Akt信號通路[18]。GPER激活PI3K后,在細胞膜上生成PIP3,PIP3與細胞內信號蛋白Akt結合,使Akt轉位至細胞膜并活化,活化的Akt通過磷酸化參與下游細胞信號轉導[14-27]。本研究Western blot結果顯示,與對照組相比,缺血再灌注組p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值明顯下降,且E2和G1干預明顯能夠上調由I/R引起的p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt下降,而G15干預后,E2上調作用明顯減弱,表明E2和G1可能通過PI3K/Akt信號通路發揮保護腎缺血再灌注作用,且E2保護作用可能主要通過激活GPER來實現。

綜上所述,E2和G1對腎缺血再灌注損傷有保護作用,其機制可能是通過激活GPER減輕氧化應激反應而實現,且E2和G1可以上調p-PI3K和p-Akt水平,由此我們推測G1與GPER結合后,可能通過激活PI3K/Akt信號通路介導氧化應激反應,減輕腎缺血再灌注損傷,但其具體保護機制還需課題組進一步深入研究。本研究初步驗證了G1對腎缺血再灌注損傷的保護作用,為臨床上G1防治腎缺血再灌注損傷提供新的藥物作用靶點。