胃腺癌組織中PD-L1與HER-2的表達及臨床意義

廉 潔，南鵬飛，張冠軍，張 昀

胃腺癌是全球最常見且是一類分子水平高度異質的惡性腫瘤。因此有必要對胃腺癌患者相關分子靶向檢測指導下的個體化治療進行更深入的研究。許多研究已證實在惡性腫瘤組織中免疫系統可以通過“免疫調節”來發揮作用，文獻報道PD-1/PD-L1相關的免疫治療靶點在胃腺癌的治療中可以獲益[1]。近年研究發現PD-L1相關的免疫治療或許可以加強機體對癌細胞的清除作用。PD-L1是PD-1的配體，在許多惡性腫瘤中均有表達，可以抑制細胞因子的分泌和PD-1陽性腫瘤相關的CD4+和CD8+細胞的溶解活性[2]，這些屬性使得PD-L1可能成為多種惡性腫瘤免疫治療新的靶點。HER-2是目前胃癌中研究最多的靶向治療的靶點，隨著對機體抗腫瘤免疫反應的不斷認識，PD-L1相關的免疫治療與抗HER-2的靶向治療是否可以共同參與胃腺癌患者的治療，兩者之間是否有一定的關系尚無定論。本實驗探索胃腺癌中PD-L1的表達，分析PD-L1與HER-2表達的相關性及對預后的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集西安交通大學醫學院第一附屬醫院2010～2015年存檔的臨床病理資料完整的胃腺癌手術標本75例，患者術前均未行放、化療治療。對患者進行隨訪，隨訪方式包括電話、再次住院病歷調查。隨訪期間內75例胃腺癌患者中存活40例，死亡35例，中位生存時間71個月；從死亡原因看，轉移至肝臟15例，轉移至肺10例，轉移至骨4例，原部位復發6例。

1.2 方法所有石蠟組織塊4 μm厚切片，PD-L1(Abcam公司，克隆號ab58810)、D2-40、S-100檢測采用免疫組化MaxVision快捷法：采用檸檬酸抗原熱修復，PD-L1采用正常扁桃體組織作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。HER-2檢測參照《胃癌HER-2檢測指南》檢測流程先將所有腫瘤切片行免疫組化檢測，將HER-2 2+病例行FISH檢測[3]。

1.3 結果判定所有免疫組化結果均由三位高年資病理醫師進行閱片，PD-L1陽性定位于細胞膜/細胞質，呈棕黃色，細顆粒狀。PD-L1判讀標準：依據PD-L1 TPS計數方法，腫瘤細胞膜染色≥1%視為陽性，總陽性腫瘤細胞數>5%視為PD-L1陽性。HER-2檢測結果：將免疫組化0、1+及2+行FISH檢測結果為未擴增的病例判定為HER-2無過表達，將免疫組化3+及免疫組化2+并FISH檢測結果為擴增的病例判定為HER-2過表達。HER-2判讀評分標準參照《胃癌HER-2檢測指南》，將免疫組化為無反應、<10%腫瘤細胞膜染色判定為0，≥10%的腫瘤細胞微弱或隱約可見膜染色或僅有部分細胞膜染色判定為1+，≥10%的腫瘤細胞有弱到中等強度的基底側膜、側膜或完全性膜染色判定為2+，≥10%的腫瘤細胞基底側膜、側膜或完全性膜強染色判定為3+[3]。

1.4 統計學分析所有數據采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。組間對比及HER-2和PD-L1陽性率與胃癌臨床病理特征間的關系分別采用χ2和Fisher精確檢驗，兩者之間的相關性采用Spearman相關性檢驗；采用Kaplan-Meier進行單因素生存分析，行Log-rank檢驗，采用Cox比例風險模型進行多因素生存分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床病理特征在75例胃腺癌中，男性63例，女性12例；年齡31～86歲，平均62歲；腫瘤位于胃食管交界部23例，胃體部19例，幽門部31例，彌漫型2例；腫瘤直徑>3 cm的56例，≤3 cm的19例；Borrmann分型：結節型6例，潰瘍局限型50例，浸潤潰瘍型16例，彌漫浸潤型3例；浸潤深度T1期2例，T2期11例，T3期25例，T4期37例；組織學WHO分型：乳頭狀型2例，管狀型67例，黏液型5例，低黏附型1例；Lauren分型：彌漫型35例，腸型40例；高分化6例，中分化40例，低分化29例；有脈管浸潤者38例；淋巴結轉移46例；神經浸潤27例；有腫瘤出芽者67例；腫瘤出芽數目≤10個/20 HPF 30例，>10個/20 HPF 45例。

2.2 胃腺癌組織中PD-L1及HER-2的表達本組75例胃腺癌中，PD-L1陽性43例，陽性率為57.3%；對HER-2行免疫組化染色并對HER-2 2+者進行FISH檢測，結果HER-2過表達例數占總數的17.3%(13/75)，無過表達例數占總數的82.7%(62/75)(圖1～3)。

2.3 胃腺癌中PD-L1表達與臨床病理特征的關系PD-L1表達與胃腺癌患者年齡、性別、腫瘤部位、大小、浸潤深度、Borrmann分型、組織學分型、神經浸潤、脈管浸潤、Lauren分型、淋巴結轉移、是否有腫瘤出芽及出芽數量均無關(P>0.05)。僅與腫瘤分化程度有關(P<0.05，表1)，進一步行Spearman相關性分析得出，PD-L1表達與分化程度呈負相關(r=-0.26，P<0.05)。

2.4 胃腺癌中HER-2和PD-L1表達的相關性75例進展期胃腺癌中，13例HER-2過表達病例中有11例PD-L1陽性，占HER-2過表達的85%。進一步行Spearman相關性分析顯示：PD-L1表達與HER-2表達呈正相關(r=0.25，P=0.029)，差異有統計學意義(表2)。

表1 胃腺癌中PD-L1表達與臨床病理特征的關系

①A①B①C①D②A②B③A③B

表2 胃腺癌中PD-L1與HER-2表達的相關性

2.5 生存分析75例胃腺癌患者隨訪1～123個月，中位隨訪時間48個月，3年生存率為61%，5年生存率為52%，中位生存時間71個月。單因素分析結果顯示：浸潤深度(P=0.006)、脈管浸潤(P=0.03)、淋巴結轉移(P=0.002)、HER-2表達(P=0.02)、腫瘤出芽數>10個/20 HPF(P=0.001)是影響胃腺癌患者預后的因素(圖4)。患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、大小、Borrmann分型、組織學分型、Lauren分型、神經浸潤、PD-L1表達與預后無明顯相關性(P>0.05)。HER-2過表達組患者的5年累積生存率低于無HER-2過表達組(P=0.02)；PD-L1陽性組患者的5年累積生存率低于陰性組，但差異無統計學意義(圖4)。分析胃腺癌中HER-2和PD-L1表達的關系對胃腺癌患者預后的影響，結果顯示：不同的HER-2和PD-L1表達組之間，其胃腺癌患者的預后存在差異：HER-2過表達PD-L1陽性組的5年生存率最低，其次是HER-2過表達PD-L1陰性組及HER-2無過表達PD-L1陽性組，胃腺癌患者的5年生存率最高為HER-2無過表達PD-L1陰性組，各組間差異有統計學意義(P=0.03，表3，圖4)。

表3 HER-2及PD-L1的單因素預后分析

圖4 單因素分析各因素的Kaplan-Meier生存曲線：A.浸潤深度；B.PD-L1表達；C.脈管浸潤；D.淋巴結轉移；E.HER-2表達狀態；F.不同HER-2及PD-L1表達組；G.腫瘤出芽數目

2.5 影響預后的多因素Cox分析對所有單因素分析中與預后有影響的危險因素進行Cox逐步回歸分析，結果顯示僅HER-2表達是影響胃腺癌患者生存期的獨立預后因素(P<0.05，表4)。

表4 影響胃癌預后的多因素Cox分析

3 討論

腫瘤細胞若要維持增長就必須要逃避或抑制免疫系統對腫瘤組織的攻擊，而機體對抗腫瘤的免疫應答主要是T細胞免疫應答，T細胞在活化的過程中需要APCs-MHC-多肽復合體與T細胞受體之間的作用，還需要共刺激分子的輔助。PD-L1作為負性刺激家族-B7家族中的一員，在腫瘤的發生發展中起到了非常重要的作用，它與腫瘤發生之間可能存在的機制如下：首先，PD-L1陽性的腫瘤組織對機體的免疫反應降低，并且T細胞對腫瘤細胞的應答反應遭到抑制；再次，腫瘤細胞中PD-L1表達可以導致特異性CD8+陽性細胞毒性淋巴細胞凋亡，導致癌組織對機體的免疫逃逸反應的發生[4]。

研究發現，PD-L1表達與胃腺癌淋巴結轉移、腫瘤大小、分化程度、腫瘤部位相關[5-6]。本實驗PD-L1表達僅與腫瘤分化程度有關，經進一步Spearman分析發現，分化程度越低的胃腺癌組織PD-L1陽性率越高，說明PD-L1表達與胃腺癌惡性程度有關。以往的研究發現，PD-L1與許多腫瘤的預后有關，例如，腎臟惡性腫瘤中PD-L1高表達意味著腫瘤進展速度快且病死率高；在術后復發的泌尿道上皮腫瘤中也發現PD-L1高表達；在胰腺癌中PD-L1陽性患者的生存率低于陰性患者。目前，PD-L1對胃腺癌預后的影響尚不十分明了，研究證實，胃腺癌中PD-L1表達與不良預后有關[7]。目前文獻報道胃腺癌中PD-L1的陽性率并沒有明確的范圍，Wu等[8]的研究中PD-L1在胃腺癌中的陽性率約為42.2%，Jiang等[9]的研究中PD-L1在胃腺癌中的陽性率為43%。可以看出，PD-L1在胃腺癌中的陽性率偏高。同時，Wu等[8]在其研究中還發現生存期小于2年的胃腺癌中PD-L1陽性率為59%，明顯高于生存期大于5年的胃腺癌患者(25.5%)。本實驗中，75例胃腺癌中43例PD-L1陽性，陽性率為57.3%，比文獻報道的PD-L1陽性率略高，這可能與本組樣本量偏小有關，需在今后的實驗中進一步擴大樣本量再加以驗證。

本實驗對研究對象進行了術后5年以上的隨訪，結果顯示PD-L1陽性病例的5年生存率為53%，低于PD-L1陰性組(59%)，這也提示PD-L1陽性患者的預后較差，但差異無統計學意義，這可能與本組樣本量偏少有關。

Suh等[10]提出在HER-2過表達的胃腺癌中PD-L1表達也相對高，在PD-L1陽性胃腺癌組織中HER-2過表達約占33%，而在HER-2過表達胃腺癌組織中PD-L1陽性率高達84%。這與本實驗中PD-L1陽性中HER-2過表達占26%，HER-2過表達組中PD-L1陽性占85%的結果基本一致，且單因素分析顯示當HER-2過表達PD-L1陽性時，患者的5年生存率最低，而HER-2無過表達PD-L1陰性時，患者的5年生存率最高。本實驗發現，胃腺癌組織中HER-2表達與PD-L1表達呈正相關(r=0.25，P<0.05)，在胃腺癌組織中HER-2過表達率越高，PD-L1陽性率也隨之升高。這可能反應了兩者共同參與胃腺癌的發生發展機制。提示同時進行抗HER-2及抗PD-L1治療或許可以提高胃腺癌患者的治療效果。

現今，有研究表明T細胞依賴的雙特異性抗體(T-cell-dependent bispecific antibodies, TDBs)可以激活腫瘤的T細胞效應，表現出很強的抗腫瘤活性，同時可以與HER-2結合。但是同時有研究發現，若腫瘤細胞表面表達PD-L1則TDBs的抗腫瘤效應大大減弱，使用PD-L1抑制劑這種抑制效應則消失。聯合使用HER-2和PD-L1的治療或許可以延緩腫瘤的進展過程[11-13]。胃腺癌治療中兩者可能的作用機制為：(1)抗PD-L1治療可以降低腫瘤細胞對免疫系統的逃逸作用，加強免疫細胞對胃癌細胞的細胞毒性殺傷作用，從而間接的加強了曲妥珠單抗對胃癌細胞的靶向清除作用；(2)抗HER-2靶向治療可以通過打破胃癌原癌基因的“成癮性”來加強抗腫瘤的免疫反應，從而引起胃癌細胞的衰老并促進T細胞的免疫清除效應。因此，抗PD-L1治療可以鞏固曲妥珠單抗的治療效果，使得曲妥珠單抗對胃腺癌的殺傷性可以持續存在，聯合使用抗HER-2和抗PD-L1治療，或許可以延緩腫瘤的進展過程[14-15]。然而，僅通過本實驗還不能明確兩者作用于進展期胃癌具體的作用機制，仍需我們進一步進行更深層次的研究。