胃癌中RNA甲基化酶NSUN2的表達及其臨床意義

沈 成，楊年釗，王明海，劉銀華，吳立勝，朱志強

胃癌是最常見的消化系統腫瘤，發病率在我國消化系統的腫瘤中居首位。盡管目前胃癌在臨床和實驗方面已有大量的研究，但近年來中晚期胃癌患者的5年生存率并未明顯的改善。5-甲基胞嘧啶(M5C)RNA甲基化修飾是RNA轉錄后的一種RNA修飾，已經證實tRNA、rRNA和mRNA中存在這種修飾[1]。甲基化后的胞嘧啶序列仍然保持相同，但發生甲基化基因的表達可能發生顯著變化。目前發現的M5C位點主要使用高通量技術結合下一代測序技術(next-generation sequencing, NGS)來證實[2]。多項實驗研究了M5C在mRNA上的分布特征[3]。NSUN2(NOP2/Sun domain family member 2)作為mRNA上的M5C催化酶和結合酶，在mRNA、tRNA和microRNA的甲基化修飾中發揮了重要作用，與腫瘤的發生、發展密切相關[4-5]。已發現NSUN2在頭頸部鱗狀細胞癌[6]和食管鱗狀細胞癌[7]等惡性腫瘤中的表達上升，但目前關于NSUN2與胃癌的相關性研究尚未見文獻報道。本實驗采用免疫組化、qRT-PCR及Western blot法檢測NSUN2的mRNA和蛋白在胃癌及對應癌旁組織中的表達差異，分析胃癌中NUSN2表達與臨床病理特征以及術后生存時間的相關性并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2010年1月～2014年12月皖南醫學院附屬第一醫院胃腸外科行胃癌根治術(D2/D3切除)并達到R0切除的手術標本109例，其中男性69例，女性40例，以患者年齡和腫瘤直徑的平均值界定分組標準。另取距離腫瘤≥5 cm的對應正常胃組織作為對照。TNM分期按照AJCC第7版分期進行[8]。本實驗通過醫院倫理委員會審核同意并批準對109例患者的生存時間進行隨訪，每3個月隨訪1次，記錄總生存時間(overall survival, OS)和無瘤生存時間(disease-free survival, DFS)，失聯患者定義為刪失數據。在手術標本中隨機挑選20例新鮮胃癌和對應正常胃組織(-80 ℃低溫冰箱中保存)，用于qRT-PCR和Western blot檢測。

1.2 主要試劑BCA試劑盒裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑購自中國碧云天公司，DAB顯色試劑盒、免疫組化SP試劑盒購自北京中杉金橋公司；NSUN2兔抗人多克隆抗體購自英國Abcam公司，蘇木精染色劑購自中國貝索生物公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 免疫組化采用SP法，所有標本經石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水檸檬酸緩沖液中孵育20 min后放入3%H2O2中10 min，加入一抗NSUN2(1∶100)4 ℃過夜后用二抗孵育30 min，加DAB顯色劑顯色，蘇木精復染，乙醇脫水，二甲苯透明，風干后鏡檢拍照記錄。每例切片均由三位病理醫師獨立閱片。NSUN2陽性定位位于細胞核，結果判斷參照文獻[9]，根據陽性著色百分比和染色強度綜合評分：陽性細胞數<10%為0分，10%～30%為1分，31%～50%為2分，>50%為3分；無陽性著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩項得分結果相乘：<5分為低表達，≥5分為高表達。

1.3.2qRT-PCR Trizol試劑盒提取胃癌及對應癌旁組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，qRT-PCR反應條件：95 ℃ 30 s預變性；5 s后控溫60 ℃退火30 s，運行40個循環。NSUN2上游引物5′-GAACTTGCCTG GCACACAAAT-3′，下游引物5′-TGCTAACAGCTTCT TGACGACTA-3′；β-actin上游引物5′-AGCGAGCAT CCCCCAAAGTT-3′，下游引物5′-GGGCACGAAGGC TCATCATT-3′。NSUN2與β-actin內參對照，實驗設3個副孔，用2-ΔΔCt方法計算mRNA的相對表達量[9]。

1.3.3Western blot 將胃癌及對應癌旁組織充分研磨后加入裂解液和蛋白酶抑制劑，使用BCA試劑盒測定總蛋白濃度，加入緩沖液煮沸變性蛋白。配制10%的SDS-PAGE，上樣蛋白電泳后轉膜到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉膜，加入一抗NSUN2和β-actin(NSUN2 1∶500，β-actin 1∶1 000)4 ℃孵育12 h。加入二抗(1∶5 000)常溫孵育60 min。Alpha-Ease FC成像系統(購自美國Alpha Innotech公司)觀察。分析NSUN2蛋白與內參蛋白灰度值，計算目標蛋白和內參蛋白灰度值的比值用于分析NSUN2蛋白表達水平。

2 結果

2.1 胃癌及癌旁組織中NUSN2的表達NUSN2主要定位于細胞核中，109例胃癌組織中NUSN2高表達率為65.1%(71/109)，而癌旁組織高表達率為15.6%(17/109)，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。

AB

2.2 胃癌中NUSN2表達與臨床病理特征的關系NUSN2表達與淋巴結轉移、浸潤深度、遠端轉移、脈管浸潤、神經侵犯、臨床分級、TNM分期有關(P<0.05)；與患者年齡、性別、腫瘤位置和直徑無關(P>0.05，表1)。

2.3 胃癌中NUSN2表達與患者生存時間的關系Kaplan-Meier生存曲線顯示胃癌中NSUN2高表達患者的OS低于NSUN2低表達患者(P=0.009，圖2)，NSUN2高表達患者的DFS也低于NSUN2低表達患者(P=0.001，圖3)。

2.4 qRT-PCR檢測NSUN2 mRNA水平qRT-PCR檢測NSUN2 mRNA的表達結果顯示，與癌旁組織相比，20對標本中有17對(85%)胃癌組織NSUN2 mRNA的表達顯著升高。定量結果表明，NSUN2 mRNA相對表達量在胃癌組織中為0.99±0.52，在癌旁組織中為0.27±0.50，差異有統計學意義(t=4.528，P<0.05，圖4)。

2.5 Western blot法檢測胃癌及癌旁組織中NSUN2的表達與癌旁組織相比，20對胃癌標本中有16對(80%)的NSUN2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05，圖5)。定量結果顯示，NSUN2蛋白的相對表達量在胃癌組織中為1.24±0.36，癌旁組織中為0.69±0.29，差異有統計學意義(t=5.363，P<0.05)。

3 討論

腫瘤的發生、發展和轉移是由遺傳基因改變和表觀遺傳學改變共同決定的。胃癌的遺傳基因常發生改變，例如p53、KRAS、PIK3CA、ARID1A、MLL3和MLL突變，以及PIK3CA、C-MET、ERBB4和CD44擴增，提示它們可能是關鍵的致癌原因，在胃癌發生、發展中發揮關鍵的作用[10-14]。除遺傳基因改變以外，表觀遺傳學的改變，包括DNA甲基化、組蛋白的翻譯后修飾、RNA轉錄后修飾等也參與了胃癌的發生、發展。NSUN2作為mRNA上的M5C催化酶和結合酶與人類癌癥的發展密切相關。Tang等[15]在研究復制性衰老過程中，發現控制細胞周期蛋白依賴性激酶p27KIP1在其mRNA上的5′Untranslated Region(5′UTR)發生M5C甲基化修飾，并且M5C的甲基化在細胞衰老過程中逐漸喪失，熒光素酶報告基因實驗發現RNA甲基轉移酶NSUN2過表達能抑制p27KIP1表達，而NSUN2敲低后p27KIP1表達升高，這表明NSUN2通過M5C甲基化修飾抑制p27KIP1翻譯。相反，細胞周期調節因子CDK1和p21的3′UTR中發生M5C甲基化修飾后，在體外和體內實驗發現會促進mRNA的翻譯。Alshaker等[16]發現在乳腺癌中NSUN2 mRNA和蛋白的表達水平提高，而正常乳腺上皮細胞和組織中NSUN2的表達水平偏低。敲低NSUN2基因后乳腺癌細胞的生長和遷移能力下降，過表達NSUN2基因后乳腺癌細胞的生長和遷移能力增強[17]。進一步研究NSUN2基因的作用機制，DNA低甲基化過表達NSUN2基因并活化原癌基因MYC，然后NSUN2作為活化的MYC靶基因，誘導細胞增殖[18]。Yang等[19]在對膽囊癌的研究發現NSUN2在正常膽囊組織中低表達，在膽囊癌細胞中高表達。研究發現NSUN2過表達下調核糖體蛋白L6(RPL6)的表達，RPL6低表達減弱了DNA損傷檢查點1(MDC1)和H2A組蛋白家族成員X的介體(γH2AX)之間的相互作用，抑制了腫瘤蛋白p53結合蛋白1(TP53BP1)和DNA修復相關蛋白(BRCA1)的表達。RPL6敲低減弱DNA損傷修復，適當的DNA損傷修復對于預防腫瘤發生至關重要[19]。綜上所述，NSUN2參與了多種腫瘤的生長和轉移。

表1 胃癌中NSUN2表達與臨床病理特征的關系

圖2 胃癌中NSUN2表達與患者總生存時間關系

圖3 胃癌中NSUN2表達與患者無瘤生存時間的關系

圖4 qRT-PCR檢測胃癌及對應癌旁組織中NSUN2 mRNA的表達

圖5 Western blot法檢測胃癌及癌旁組織中NSUN2的表達：T.胃癌組織；N.癌旁組織

本實驗通過對NSUN2在胃癌及癌旁組織中的表達進行檢測，分析NSUN2表達與胃癌臨床病理特征以及患者預后的關系。本實驗中免疫組化、Western blot及qRT-PCR檢測結果均顯示與癌旁組織相比，胃癌組織中NSUN2表達量明顯上升，NSUN2表達上調與淋巴結轉移、浸潤深度、遠端轉移、脈管浸潤、神經侵犯、臨床分級、TNM分期密切有關；與患者年齡、性別、腫瘤位置及直徑無顯著相關性。生存分析顯示NSUN2高表達患者術后的OS和DFS明顯下降，這表明NSUN2表達與胃癌的增殖和侵襲能力相關，NSUN2高表達多提示胃癌較高的惡性程度及更差的預后。qRT-PCR及Western blot法從轉錄和蛋白表達水平證實NSUN2基因在胃癌和癌旁組織中的表達差異，揭示了NSUN2基因可能在轉錄后以及蛋白翻譯過程中影響胃癌的發展?？傊?，本實驗結果提示NSUN2表達與胃癌TNM分期和侵襲性顯著相關，NSUN2表達影響患者預后，通過檢測NSUN2表達可以評判胃癌患者病情和預后，未來有希望以調控NSUN2表達為靶點干預胃癌的發展進程和患者的預后。

本實驗作為單中心小樣本的回顧性分析，不可避免的具有一定的選擇偏倚，并且缺少體外體內實驗的進一步驗證，因此有待進一步擴大樣本量和深入的作用機制研究?？傊?，對NSUN2在胃癌中的工作靶點及具體的調控機制進行基因層面上的深入研究對臨床上胃癌的治療有重要意義，可以為胃癌診斷和治療提供新思路。