腦膜瘤組織中HIF-1α、EphA2蛋白的表達及意義

左延卿，崔 明，王 煒，邢益祥，趙 鐵，代興亮

腦膜瘤起源于蛛網膜細胞，發病率高，占中樞神經系統原發性腫瘤30%以上。WHO(2016)中樞神經系統腫瘤分類將腦膜瘤分為3級：Ⅰ級為良性腫瘤，但術后臨床上仍有較多復發；Ⅱ級為非典型腦膜瘤；Ⅲ級為惡性，具有強侵襲性和高復發率[1]。腫瘤生長需要營養供應，腦膜瘤快速增長需要其微環境增加供氧量[2]。缺氧誘導因子-1α(hypoxia induc ible factor-1α, HIF-1α)及下游的血管生成有關標志性蛋白上皮細胞激酶A2(epithelial cell kinase A2, EphA2)參與腫瘤的營養供應[3]。研究發現，在高侵襲性黑色素瘤細胞中EphA2高表達[4]；EphA2在胃癌組織中的表達明顯高于正常胃組織，抑制EphA2蛋白表達，可抑制胃癌細胞的生長[5]。但HIF-1α、EphA2表達與腦膜瘤臨床病理分級和復發的關系文獻報道較少。本文著重探討腦膜瘤中HIF-1α、EphA2蛋白表達及其與臨床病理特征的關系，為腦膜瘤臨床診療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014年1月～2017年12月安徽醫科大學第一附屬醫院和安徽省銅陵市人民醫院存檔的68例腦膜瘤組織標本，均為初診并行手術治療，68例腦膜瘤患者均為0級Simpson切除，手術完整切除腫塊和累及的硬腦膜組織，再切除周圍擴大約2 cm的硬腦膜，術后經病理學均證實為腦膜瘤。其中男性27例(占39.7%)，女性41例(占60.3%)；年齡40～78歲，平均(52.4±13.6)歲；術前患者均未行放、化療。所有患者均對該項研究知情同意，按照WHO腦膜瘤分級，其中Ⅰ級37例，Ⅱ級18例，Ⅲ級13例。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 免疫組化染色采用SP法，手術切除腫瘤組織均經10%中性福爾馬林固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，連續4 μm厚切片，60 ℃烘箱烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，檸檬酸鈉微波抗原修復，羊血清封閉，按照試劑盒說明書操作，滴加一抗(兔抗人多克隆抗體)，4 ℃孵育過夜，滴加酶標羊抗兔抗體，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固，鏡下觀察。以PBS替代一抗作為陰性對照。兔抗人HIF-1α、EphA2單克隆抗體購于Santa Cruz公司；DAB顯色試劑盒、SP試劑盒購于武漢博士德公司。

1.2.2Western blot法 取液氮凍存的手術切除的不同級別腦膜瘤組織，添加RIPA組織蛋白裂解液，研磨、超聲破碎，蛋白濃度測定采取BCA法。取30 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE電泳，分別加入兔抗人HIF-1α和EphA2多克隆抗體(PBS稀釋1∶1 500)，次日孵育二抗，ECL化學發光、顯影，Image J軟件分析灰度，以GAPDH為內參(PBS稀釋1∶2 000)，HIF-1α和EphA2蛋白灰度值和內參照條帶灰度值的比值表示蛋白相對表達量，實驗重復3次。

1.3 結果判斷HIF-1α、EphA2結果判定由3名資深病理科醫師獨立完成，陽性細胞判定為細胞質、細胞核染色均勻，呈棕黃色或棕褐色；免疫組化染色陽性計分參考文獻[6]，根據陽性細胞著色強度計分：無陽性著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；得分0～1分為低表達，2～3分為高表達。

1.4 隨訪68例腦膜瘤患者術后復發情況采取門診和電話咨詢，隨訪時間從手術日開始，截至2018年12月，其中4例患者失訪，隨訪時間12～60個月，中位時間36個月，隨訪中發現腦膜瘤復發者9例，其中Ⅰ級1例，Ⅱ級4例，Ⅲ級4例。

2 結果

2.1 腦膜瘤組織中HIF-1α、EphA2蛋白的表達68例腦膜瘤中，HIF-1α蛋白高表達32例(47.1%)，低表達36例(52.9%)，陽性主要定位于細胞質和細胞核(圖1、2)；EphA2蛋白高表達35例(51.5%)，低表達33例(48.5%)，以細胞質和細胞核呈黃色和棕黃色為陽性(圖3、4)。

2.2 不同分級腦膜瘤組織中HIF-1α和EphA2蛋白的表達WHO將腦膜瘤分為Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級，本組采用免疫組化染色觀察到隨著腦膜瘤級別的升高，HIF-1α和EphA2的表達呈升高趨勢，不同組間差異有統計學意義(χ2=27.019，30.442，P<0.001，表1)。

表1 不同級別腦膜瘤組織中HIF-1α與EphA2蛋白的表達

2.3 Western blot法檢測腦膜瘤組織中HIF-1α和EphA2蛋白的表達Western blot法檢測不同級別腦膜瘤組織中HIF-1α和EphA2蛋白的表達結果顯示，與Ⅰ級腦膜瘤組織相比，Ⅱ級和Ⅲ級分化的腦膜瘤組織中HIF-1α和EphA2蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義(P=0.032，P=0.005；P=0.026，P=0.004，圖5)。

①②③④

圖5 Western blot法檢測HIF-1α和EphA2的蛋白表達：A.Western blot檢測結果；B.蛋白表達的半定量統計；*P<0.05，**P<0.01

2.4 腦膜瘤中HIF-1α與EphA2表達與患者復發的關系68例腦膜瘤患者隨訪12～60個月，中位時間為36個月，4例失訪，有9例患者復發：復發者Ⅰ級1例(1/37，2.7%)，Ⅱ級4例(4/18，22.2%)，Ⅲ級4例(4/13，30.8%)。9例復發病例的HIF-1α蛋白表達免疫組化評分為2.82±1.08，59例非復發病例免疫組化評分為1.51±1.14，復發組較非復發組的評分顯著增高(P<0.01)。9例復發病例的EphA2蛋白表達免疫組化評分為2.91±1.15，非復發組免疫組化評分為(1.53±1.18)，復發組較非復發組的評分顯著增高(P<0.01)。

3 討論

腦膜瘤是常見的顱內原發腫瘤，手術是目前治療腦膜瘤主要手段。WHO(2016)將腦膜瘤分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級，Ⅰ級雖然多為良性腫瘤，但也會復發和致死[3]。腫瘤切除范圍、腫瘤浸潤與轉移、惡性程度、腫瘤部位等原因是腦膜瘤術后復發的主要原因，復發腦膜瘤治療目前尚缺乏統一認識。本組68例腦膜瘤患者，即使采用0級Simpson切除，仍有9例(13.2%)復發，與國內外報道結果較一致[1,7]，目前腦膜瘤復發的分子機制尚不清楚。

腫瘤在發展進程中，由于其快速增長，必然會出現缺血、缺氧，為增加其微環境中供氧，除血管內皮管網外，常形成自身的管道結構[2]。朱園園等[8]研究表明，HIF-1α在子宮內膜腺癌中的陽性率明顯高于增殖期子宮內膜和不典型增生患者，且與子宮內膜腺癌組織學分級、淋巴結轉移、臨床分期等相關，檢測HIF-1α蛋白表達可能為子宮內膜腺癌的診療和預后提供依據。朱振華等[9]在胃癌中的研究發現，與癌旁正常組織相比，EphA2在胃癌組織中的陽性率顯著升高，且其表達與胃癌TNM分期、浸潤程度和淋巴結轉移呈正相關。本實驗結果同樣提示，缺氧誘導因子HIF-1α、EphA2在腦膜瘤組織中表達升高，且與腦膜瘤分級有關。HIF-1α參與機體多種生理、病理過程，是哺乳動物機體在缺氧狀態下，具有特異性的活化轉錄因子，與多條細胞信號轉導通路有關，尤其是介導缺氧信號轉導，能夠調控細胞的生長、增殖和凋亡等過程[10]。跨膜酪氨酸激酶受體EphA2是一種酪氨酸激酶受體超家族成員，可調控腫瘤細胞行為，實體腫瘤的快速生長易致瘤體內部出現缺氧缺血微環境，缺氧相關因子表達失衡，在人和哺乳動物體內常出現HIF-1α表達上調[11]。HIF-1α核定位后，與缺氧應答元素，如血管內皮生長因子和EphA2等目標基因結合，參與腫瘤的侵襲和轉移[12]。本組結果證實隨著腦膜瘤組織臨床級別的升高和腫瘤復發，HIF-1α、EphA2表達呈上升趨勢，提示HIF-1α、EphA2參與腦膜瘤的病變。

綜上所述，HIF-1α、EphA2可能促進腦膜瘤的浸潤和轉移，聯合檢測HIF-1α和EphA2可能作為腦膜瘤預后的指標。