GPIHBP1基因敲除小鼠在嚴重高三酰甘油血癥急性胰腺炎導致肺損傷研究中的應用

柳 鑫 徐有青 崔純瑩 趙志剛*

(1. 首都醫科大學附屬北京天壇醫院藥學部，北京 100070； 2. 首都醫科大學附屬北京天壇醫院消化內科，北京 100070； 3. 首都醫科大學藥學院，北京 100069)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是發生在胰腺內部和胰腺外周的一種急性炎性反應。胰腺腺泡內聚集的溶酶體酶與消化酶，催化胰蛋白酶原生成胰蛋白酶，導致腺泡細胞裂解[1]。急性胰腺炎會引起器官衰竭，在急性炎性反應階段，胰腺內小葉動脈括約肌受損，發生局部性狹窄，血流量減少，胰腺組織發生壞死，胰腺外器官受損，引起肺、腎臟與肝臟等多器官功能紊亂，這是導致重癥急性胰腺炎發病與死亡的原因之一[2]，在美國，每年每10萬成年人中，約有40例急性胰腺炎患者死于器官功能障礙[3]。

嚴重高三酰甘油血癥導致急性胰腺炎易感性增加，在急性胰腺炎的誘發因素中占比達到近10%[4]。流行病學調查[5]顯示，當患者的血漿三酰甘油濃度高于1 000 mg/dL與2 000 mg/dL時，發生急性胰腺炎的比例分別為5%和10%～20%。在體內脂質代謝過程中，脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)作為三酰甘油水解的限速酶[6]，其發揮作用依賴于糖基化磷脂酰肌醇錨定高密度脂蛋白結合蛋白1(glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1，GPIHBP1)[7]。GPIHBP1在血管內皮下與LPL結合，作為其發揮脂解作用時的重要錨定結合蛋白，當GPIHBP1基因發生功能缺失性突變，將導致LPL無法正常發揮脂質分解作用，引起血漿三酰甘油濃度極度升高[8]。

目前，有關GPIHBP1基因敲除小鼠應用于急性胰腺炎的研究尚未見報道，嚴重高三酰甘油血癥急性胰腺炎是否會引起急性肺損傷，也未明確。本研究擬采用GPIHBP1基因敲除小鼠進行實驗，建立急性胰腺炎動物模型，探討嚴重高三酰甘油血癥時急性胰腺炎與肺損傷的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

GPIHBP1基因敲除小鼠，由美國Jackson實驗室提供，為C57BL/6J背景，8周齡，雄性小鼠；對照為同窩野生型小鼠。實驗動物飼養于北京大學醫學部，實驗動物許可證號：LA2010-059，環境溫度為20～24 ℃，正常日光周期，自由進食及飲水，保持墊料干燥。

雨蛙素購自美國Sigma公司，生化試劑盒(淀粉酶、三酰甘油、總膽固醇與血糖等試劑盒)購自中生北控生物科技公司。

1.2 動物分組及基因型鑒定

實驗分為2組：WT組(野生型)和GPIHBP1-/-組(GPIHBP1基因敲除)，每組6只。采用PCR鑒定和血脂分析(血漿三酰甘油濃度測定)，雙重篩選確認基因型。所采用引物見表1。監測體質量，禁食12 h，內眥取血，檢測血漿葡萄糖與脂質含量。

表1 基因型鑒定的引物序列

1.3 急性胰腺炎誘導

兩組小鼠自由飲水狀態禁食12 h，腹腔注射雨蛙素(50 μg/kg)，1次/h，連續注射7次，誘導胰腺炎，24 h 后處死小鼠，采用PBS灌流，取胰腺與肺組織，進行形態分析。

1.4 血漿淀粉酶活性檢測

禁食12 h后，在不同時間點(0、9、12及24 h),內眥采血，肝素抗凝，高速離心(4 ℃，12 000 r/min，60 min)，小心吸取下層澄清液3 μL入96孔板，加入淀粉酶工作液100 μL，37 ℃孵育3 min，入酶標儀分別于605 nm波長處讀取不同時間點(1 min末、2 min 末、3 min末)的A值，計算淀粉酶活性(U/L)= [A值(3 min)-A值(1 min)]/2×3 245×稀釋倍數，當[A值(3 min)-A值(1 min)]/2>0.3時，用去離子水稀釋測定，每組樣品測定3次，取平均值。

1.5 胰腺與肺組織染色與病理評估

取胰腺與肺組織，分別給予25%～100%(體積分數)乙醇浸泡10 min，脫水，二甲苯浸泡，至組織透明，加入液態石蠟，在60 ℃保溫30 min，采用石蠟切片，用二甲苯脫蠟，無水乙醇洗脫二甲苯，分別使用蘇木精-伊紅染色1 min，二甲苯洗脫處理后，中性樹膠封片，采集圖像，分別進行胰腺與肺組織病理評分(表2，3)。

表2 胰腺組織病理評分標準

表3 肺組織病理評分標準

1.6 肺泡灌洗

給予1%(質量分數)異戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，經氣管插管，行肺泡灌洗，灌入0.9%(質量分數)氯化鈉注射液500 μL/次，共6次，抽吸計回收量。收集灌洗液于離心管中，回收率>80%為合格標本。取10 μL用于細胞計總數，細胞懸液滴于計數板上，使懸液自由充滿蓋片下方間隙，勿留氣泡，在光鏡下觀察并數出四角大格內的細胞數，壓線時只計上線和右線的細胞，然后按下式計算出細胞總數：細胞數=(四大格中的細胞總數/4)×104/mL；回收液細胞總數=每毫升細胞數×回收肺泡灌洗液總量。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 基因型鑒定與血脂濃度

為了鑒定基因型，本研究設計兩對引物，其中一對引物設計在敲除片段上，野生型在517 bp處有一亮條帶顯示，而敲除小鼠無亮帶顯示，另一對引物設計在敲除片段的上游與下游，在野生小鼠中，由于PCR產物較長，無法有效獲得PCR產物，而在敲除小鼠中，由于刪除一段后在801 bp處可見一亮條帶(圖1)。GPIHBP1-/-小鼠體質量及血糖值與WT小鼠比較，差異無統計學意義(P>0.05，圖2A、B)，GPIHBP1-/-小鼠血漿三酰甘油與總膽固醇濃度均明顯高于WT小鼠，差異有統計學意義(P<0.05，圖2C、D)。

圖1 GPIHBP1-/-小鼠基因型鑒定Fig.1 Genotype identification of GPIHBP1-/- miceGPIHBP1： glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1.

圖2 GPIHBP1-/-小鼠血漿脂質升高Fig.2 GPIHBP1-/- mice showed higher plasma levels of lipidsA: body weight； B: glucose； C: triglyceride； D: total cholesterol；n=6，*P<0.05； WT： wild type； GPIHBP1：glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1.

2.2 血漿淀粉酶活性檢測

隨著時間變化，GPIHBP1-/-小鼠與WT小鼠血漿淀粉酶活性均發生明顯改變(F時間=21.359，P=0.004)，但組間差異無統計學意義(F組間=0.203，P=0.668)(圖3)。

圖3 GPIHBP1-/-小鼠血漿淀粉酶活性Fig.3 Amylase activity in GPIHBP1-/- mice WT： wild type; GPIHBP1： glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1.

2.3 胰腺與肺病理損傷

與WT小鼠相比，GPIHBP1-/-小鼠胰腺水腫病變顯著，小葉內部有較寬間隙，炎性細胞于葉間積聚(圖4)。胰腺病理評分比較，GPIHBP1-/-小鼠明顯高于WT小鼠，差異有統計學意義(P<0.05)(表3)。

肺組織病理切片HE染色結果顯示，GPIHBP1-/-小鼠較WT小鼠肺組織病理改變較顯著，光鏡下可見肺泡間隔內毛細血管擴張充盈，炎細胞浸潤明顯，偶

見支氣管壁增厚、氣道上皮壞死、糜爛和氣道壁炎細胞浸潤、杯狀上皮化生、平滑肌細胞增生肥大等表現(圖5)。對肺組織肺泡間隔內炎細胞浸潤指標進行病理評分，GPIHBP1-/-小鼠高于WT小鼠，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 兩種小鼠胰腺組織和肺組織病理學評分

圖4 GPIHBP1-/-小鼠胰腺病理損傷明顯加重Fig.4 Pathological damage of pancreas in GPIHBP1-/- mice significantly aggravated(HE staining,Scale bar=200 μm)A: WT mice； B: GPIHBP1-/- mice； WT： wild type； GPIHBP1： glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1.

圖5 GPIHBP1-/-小鼠肺病理損傷顯著加重Fig.5 Pathological damage of lungs in GPIHBP1-/- mice significantly aggravated(HE staining, Scale bar=200 μm)A: WT mice； B: GPIHBP1-/- mice； WT：wild type； GPIHBP1： glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1.

2.4 GPIHBP1-/-急性胰腺炎小鼠肺泡灌洗液細胞計數

對誘導急性胰腺炎后的GPIHBP1-/-小鼠與WT小鼠分別行支氣管插管和肺泡灌洗，對肺泡灌洗液細胞進行計數(圖6)，GPIHBP1-/-小鼠支氣管肺泡灌洗液中細胞總數百分比較WT小鼠增加1.63倍，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖6 GPIHBP1-/-小鼠肺泡灌洗液細胞總數增加Fig.6 Total number of cells in alveolar lavage increased in GPIHBP1-/- mice*P<0.05; WT：wild type； GPIHBP1： glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1.

3 討論

本研究中GPIHBP1基因缺失導致的嚴重高三酰甘油血癥小鼠，急性胰腺炎易感性增高，肺組織病理明顯改變，急性肺泡炎性反應加重，肺泡間隔內中性粒細胞增多。

在探索嚴重高三酰甘油血癥急性胰腺炎與肺損傷病理改變時，本研究采用了一種特殊的基因工程動物模型：GPIHBP1基因敲除小鼠。GPIHBP1基因敲除后，可導致血漿三酰甘油升高10倍以上(超過1 000 mg/dL)，且不影響動物的全身狀態，繁殖容易，存活率高，是一種較為理想的嚴重高三酰甘油血癥小動物模型。給予雨蛙素誘導急性胰腺炎后，GPIHBP1基因敲除小鼠的血漿淀粉酶活性隨時間發生明顯變化，盡管組間差異無統計學意義，但在臨床中也確有相關報道[9-10]。高三酰甘油血癥胰腺炎患者的血漿淀粉酶活性在正常范圍內波動，血漿淀粉酶活性可能并不是一個較靈敏的生物標志物，對于臨床診療意義不大。

在急性胰腺炎進展過程中產生的大量炎性細胞因子，是引起胰腺外組織產生炎性反應的重要原因之一[11]。其病理進程可分為三個階段，局部刺激引起鈣離子釋放，酶原激活，胰腺細胞受損，出現早期癥狀如上腹部疼痛；進而在損傷的腺泡細胞內部，出現酶原活化的正反饋調節，胰腺自身逐漸被消化，炎性反應向胰腺外組織擴散；在炎性反應進一步擴散中，血管通透性升高，胰腺內外募集的多種炎性反應因子進一步侵襲胰腺外組織。其中，肺組織最早出現病理改變[12]。肺損傷在急性胰腺炎患者中發生率較高，這也是導致急性胰腺炎并發多器官功能障礙的重要原因。當患者出現急性胰腺炎合并急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征時，病死率達到30%～40%[13]。本實驗結果表明，GPIHBP1基因缺失引起的嚴重高三酰甘油血癥，在誘發急性胰腺炎后伴有肺損傷病理改變，肺泡灌洗液中細胞數目增多。

磷脂酶A2含量增加與肺損傷具有一定的相關性[14]。在生理狀態下，II型肺細胞產生的表面活性物質能夠維持肺泡穩定性，如果肺表面活性物質的數量與功能發生改變，肺組織的結構與功能會隨之發生病變[15]。急性胰腺炎時釋放大量炎性反應因子及多種生物活性物質，包括磷脂酶A2，后者能水解肺泡表面活性物質。嚴重高三酰甘油血癥時急性胰腺炎易感性增加，可能與游離脂肪酸增多及炎性反應密切相關[5]。另一方面，嚴重高三酰甘油血癥時內皮細胞功能發生紊亂，多種炎性反應因子如磷脂酶A2募集于血液中及內皮細胞下[16]，這可能也是嚴重高三酰甘油血癥時急性胰腺炎并發肺損傷的重要機制之一。

通過建立急性胰腺炎肺損傷模型，對進一步探討急性胰腺炎時的肺損傷病理機制，以及改善臨床癥狀與降低病死率尤為重要[17-18]。目前，臨床對癥治療主要集中于兩方面：抑制炎性反應與改善肺功能。臨床前研究及臨床試驗[19-20]嘗試通過藥物調節炎性反應降低肺損傷，但均未獲得實質性進展。近些年，重癥急性胰腺炎合并肺損傷的病死率有所下降，主要緣于重癥監護病房(intensive care unit，ICU)護理對肺通氣功能的改善。但是，在急性胰腺炎的實驗動物模型中，尚缺乏能夠有效改善肺損傷的治療手段，而在臨床實踐中，也缺乏有效措施來抑制急性胰腺炎引起的全身性炎性反應。

本研究應用GPIHBP1基因缺失的嚴重高三酰甘油血癥小鼠模型，誘導急性胰腺炎，胰腺與肺組織病理損傷均明顯加重，初步證實GPIHBP1基因敲除小鼠可作為理想的嚴重高三酰甘油血癥動物模型，用于進一步的肺損傷發病機制研究，對進一步調節急性胰腺炎引起的遠端組織器官功能紊亂，以及促進臨床轉化，具有一定的臨床理論與實用價值。