基于網絡藥理學探討哮喘寧顆粒防治心理應激哮喘的作用網絡與潛在機制

弓雪峰 任培中 崔紅生姜振遠 張詩瑜 王佳美 張馨予 陳秋儀呂明圣 候 丹

(1.北京中醫藥大學第三附屬醫院呼吸科，北京 100029；2.北京中醫藥大學，北京 100029；3.山東中醫藥大學第一臨床醫學院腦病科，濟南 250355)

支氣管哮喘(簡稱“哮喘”)是一種典型的心身疾病，長期反復發作影響心身健康[1]。隨著現代人生活節奏加快，承受社會壓力日益增大，焦慮、抑郁等相關的心理應激[2]導致哮喘發病率逐漸升高[3]，心理問題成為哮喘預后不良的重要因素[4]。心理應激哮喘作為新的表型，被認為與“神經-內分泌-免疫”(neuro-endocrine-immune, NEI)網絡調節失衡相關[5]。一方面哮喘可伴發焦慮、抑郁、恐懼等心理障礙，另一方面上述心理異常又成為誘發哮喘發作的重要因素，兩者之間互為因果，惡性循環，反復發作，遷延不愈[6]。其治療方案除應用β2受體激動劑、糖皮質激素等控制與緩解之外，針對心理應激哮喘的中醫藥深入研究迫在眉睫。

中醫學認為，肝肺生理相關，肺主治節而吐濁納清，肝主疏泄而調暢氣機，肝與肺共司氣機升降，若運行正常，則氣血調暢；同時，肝肺病理相因，若樞機不利，則有木叩金鳴、木火刑金、風搖鐘鳴等病理變化[7]。心理應激哮喘患者素體肺氣壅塞，膈間膠固痰伏，遇情志不遂、肝氣失暢而誘發，肝木郁滯，反侮肺金，肺失肅降，氣逆于上，發為咳喘，核心病機在于氣郁痰阻，肝肺失和。首都國醫名師武維屏教授在“調肝理肺”的思想指導下創制了哮喘寧顆粒(北京中醫藥大學東直門醫院院內制劑)，取法于四逆散與小柴胡湯，解肝氣之郁逆，調少陽之樞機，合炙麻黃、前胡等止咳平喘之品，共奏調肝理肺之功，臨床應用三十余年，療效顯著，有效控制哮喘急性發作[8]，并可改善哮喘患者血瘀狀況[9]。本團隊臨床研究[8]顯示，哮喘寧治療支氣管哮喘的臨床控制率與顯效率高，總有效率達90.0%，證明此復方不但抑制氣道免疫炎性反應，而且還能夠通過調節白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)/干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)，促成機體免疫平衡；另一臨床研究[9]通過測定血流變相關指標，得知哮喘寧顆?？娠@著改善哮喘患者血小板黏附，抑制血小板聚集。前期基礎研究[10-12]表明哮喘寧顆粒劑有上調哮喘大鼠肺組織糖皮質激素受體和血清皮質醇的功能，也能夠下調氣道相關炎性反應介質如白三烯B4、白三烯C4、C-反應蛋白等的表達[13]。但哮喘寧顆粒成分復雜，靶點眾多，對于防治心理應激哮喘的作用機制尚不明確。因此，本研究擬通過網絡藥理學方法，構建哮喘寧顆?！八幬?成分-靶點”網絡，建立“哮喘寧顆粒-心理應激哮喘”靶點互作網絡，通過基因層面與富集分析闡釋哮喘寧顆粒防治心理應激哮喘的潛在作用機制，以期為心理應激哮喘提供中醫藥防治新思路。

1 材料與方法

1.1 篩選哮喘寧顆粒有效成分與潛在靶點

哮喘寧顆粒為北京中醫藥大學東直門醫院院內制劑。藥物組成：柴胡10 g、黃芩10 g、清半夏10 g、白芍10g 、枳殼10 g、炙甘草6 g、地龍15 g、炙麻黃6 g、葶藶子10 g、前胡10 g、丹參15 g。

通過中藥系統藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform， TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp. php)、中藥分子機制生物信息學分析網絡(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[14]等數據平臺檢索哮喘寧顆粒中所有藥物的全部化學成分。TCMSP數據庫以化合物口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和藥物相似度(drug likeness，DL)≥0.18 作為主要有效成分的篩選條件[15]。同時在BATMAN-TCM平臺對藥物進行檢索，檢索條件為 score cutoff≥20，P-value cutoff<0.05；檢索的藥物成分通過OB≥30%和DL≥0.18篩選，得到對應的化合物信息。將兩個數據庫的有效成分與預測靶點合并，建立哮喘寧顆粒化學成分-靶點數據庫。篩選、去重后獲得哮喘寧顆粒復方潛在靶點，利用Cytoscape3.7.2構建藥物-成分-靶點作用網絡。

1.2 尋找心理應激哮喘的疾病靶點

通過在Genecards基因數據庫(https://www.genecards.org)、藥物靶標數據庫(Therapeutic Target Database, TTD， http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、比較毒理基因組學數據庫(Comparative Toxicogenomics Database, CTD， http://ctdbase.org/)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM，http://www.omim.org/)以及 DisGenet(http://disgenet.org/)等數據庫檢索，并結合相關文獻取并集，尋找與心理應激哮喘疾病相關的人類靶點。

1.3 確定“哮喘寧顆粒-心理應激哮喘”藥物-疾病交集靶點

通過韋恩圖確定哮喘寧顆粒與心理應激哮喘的藥物-疾病交集靶點及其對應藥物主要化合物。通過SymMap數據庫(https://www.symmap.org/)查詢化合物CAS號。

1.4 構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡

將哮喘寧顆粒-心理應激哮喘共同作用靶點導入STRING數據庫(https://string-db.org/)中，以中置信度分數score≥0.4條件進行篩選[16-17]，并隱藏網絡中無聯系的節點，余參數不變，將得到的結果以文本形式導入Cytoscape3.7.2軟件中進行可視化，并使用Cytoscape3.7.2的插件MCODE、cytohubba及拓撲運算后篩選顯著性高的PPI網絡的模塊，MCODE插件篩選標準為degree cutoff=2，node score cutoff=0.2，K-score=2，max deapth=100，以P<0.05表示差異有統計學意義；cytohubba插件篩選標準為計算節點分值排序后，取前10位顯著性基因；以拓撲運算，得到中心度值(between centrality, BC)、親中心度值(closeness centrality, CC)、等級值(degree)，通過均值篩選。分別篩選基因后，取以上三者交集靶點。

1.5 基因本體(Gene Ontology, GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析

利用David 6.8數據庫(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, DAVID, https://david.ncifcrf.gov/)[18]對哮喘寧顆粒和心理應激哮喘共同作用靶點蛋白進行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能分析主要用于描述基因靶點的功能，KEGG富集分析可以得到哮喘寧顆粒和心理應激哮喘共同靶點所富集的信號通路。GO和KEGG分析均以P<0.05表示具有統計學意義。

2 結果

2.1 哮喘寧顆粒主要有效成分篩選結果

通過在TCMSP及BATMAN-TCM平臺等檢索后合并信息，運用Cytoscape軟件構建哮喘寧顆?！八幬?成分-靶點”網絡(圖1)。在以上網絡中進一步篩選結果，共獲得哮喘寧顆粒中的主要有效成分39個(表1)，相應潛在靶點121個。

2.2 心理應激哮喘疾病靶點篩選

通過在Genecards、TTD、CTD、OMIM、DisGeNet等數據庫檢索，并結合相關文獻取并集，共得到與心理應激哮喘疾病相關人類靶點1 063個。

2.3 “哮喘寧顆粒-心理應激哮喘”藥物-疾病交集靶點

通過韋恩圖(圖2)找出哮喘寧顆粒和心理應激哮喘交集靶點NOS2、PTGS1、F2ESR1、AR、PPARG、PTGS2、ADRB2、ESR2、DPP4、MAPK14、GSK3B、XDH、NOS3、F7、IL6等，共計72個。對應哮喘寧顆粒藥物主要化合物有11個，詳見表2。其中，柴胡對應蓽澄茄素、異鼠李素、茵陳黃酮，白芍對應丁子香萜、β-谷甾醇、谷甾醇、山奈酚、兒茶素，枳殼對應柚皮素、川陳皮素，麻黃、葶藶子對應槲皮素。

2.4 PPI網絡的構建及關鍵基因篩選

將72個共同靶點導入STRING中，結果如圖3(圖中線條顏色表示相互作用證據的類型),得到292對相互作用關系，將結果以文本形式導出，然后導入Cytoscape 3.7.2軟件中，利用 Cytoscape軟件中的MCODE插件將哮喘寧顆粒靶點PPI網絡進行聚類分析，其聚類詳細信息見表3，得到顯著性最高的功能模塊(圖4)，用cytohubba插件得到前10位關鍵基因：MAPK1、TP53、TNF、VEGFA、EGF、IL1β、MAPK8、PTGS2、JUN、IL6(圖5)。拓撲得到的關鍵基因：F2、AR、CAT、MAPK1、TP53、TNF、VEGFA、EGF、IL1B、MAPK8、PTGS2、JUN、IL6。三者交集的關鍵靶點為MAPK1、TNF、VEGFA、EGF、MAPK8、PTGS2、JUN、IL6。

圖1 哮喘寧顆?！八幬?成分-靶點”網絡Fig.1 Herb-component-target network of Xiaochuanning GranulePink arrow represents herbs contained in Xiaochuanning Granule, deep yellow rounded rectangles represents main active chemical components of herbs, blue ovals represents the corresponding targets.

表1 哮喘寧顆粒中的主要有效成分基本信息

續表1

圖2 哮喘寧顆粒與心理應激哮喘靶點韋恩圖Fig.2 Wynne diagram of targets of Xiaochuanning Granule and psychological stress asthmaBlue part represents the targets of Xiaochuanning Granule, bright yellow part represents the targets of psychological stress asthma, dark yellow part represents the common targets.

表2 共同靶點對應哮喘寧顆粒主要化合物列表

圖4 基于MCODE插件的哮喘寧顆粒-心理應激哮喘基因互作模塊Fig.4 Gene interaction modules of Xiaochuanning Granule and psychological stress asthma based on MCODE plug-in

圖5 基于cytohubba插件得到前10位的哮喘寧顆粒-心理應激哮喘基因互作圖Fig.5 Top 10 genes interactions between Xiaochuanning Granule and psychological stress asthma based on cytohubba plug-in

2.5 哮喘寧顆粒-心理應激哮喘交集基因的GO與KEGG富集分析

2.5.1 GO功能富集分析結果

根據顯著性程度P<0.05(P值由小到大)進行部分展示，GO分析結果提示哮喘寧顆粒-心理應激哮喘交集基因的生物學過程(biological process，BP)顯著富集在耐藥反應、缺氧反應、一氧化氮生物合成過程的正調控、細胞增生的正調控、細胞對脂多糖的反應、轉錄的正調控、DNA模板化、雌二醇反應、基因表達的正調控、脂多糖介導的信號通路、MAPK通路激活、脂多糖反應、信號轉導等；細胞組分(cellular component，CC)主要富集在質膜、胞外區、細胞表面、分泌顆粒、突觸、軸突末端、突觸后膜、樹突細胞質等；分子功能(molecular function，MF)主要富集在酶結合、類固醇結合、類固醇激素受體活性、蛋白質同源二聚化活性、藥物結合、血紅素結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性、配體激活的序列特異性DNA結合、轉錄因子結合、序列特異性DNA結合等(表4、圖6)。

2.5.2 KEGG富集分析結果

KEGG富集分析得到通路98條，根據P<0.05并結合相關文獻進行篩選得到相關性較強的20條生物學通路(表5、圖7)。其中，相關疾病有查加斯病(Chagas’ disease )、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)等9種，信號通路主要有TNF通路、低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)信號通路、腫瘤相關通路、神經活性配體受體相互作用通路、鈣離子信號通路、PI3K-Akt信號通路、NOD樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)信號通路等。分析結果表明，哮喘寧顆?？赡芡ㄟ^T細胞受體介導免疫系統、神經活性配體受體相互作用等通路起到防治心理應激哮喘的作用。

3 討論

中藥復方在分子水平上是多組分、多靶點的藥物集合，網絡藥理學逐漸成為目前對中醫藥(尤其是復方等)的重要研究方法，在分子水平和生物學網絡背景下研究中藥作用機理[19]。本研究運用此研究范式，以有效利用現代生物醫學信息，解釋哮喘寧顆粒治療心理應激哮喘NEI網絡潛在機制。

表4 哮喘寧顆粒防治心理應激哮喘的GO富集分析

續表4

圖6 哮喘寧顆粒防治心理應激哮喘的GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis in the prevention and treatment of psychological stress asthma by Xiaochuanning GranuleGO： Gene Ontology.

表5 哮喘寧顆粒防治心理應激哮喘的KEGG富集分析前20位通路

圖7 哮喘寧顆粒防治心理應激哮喘的KEGG富集分析前20位通路Fig.7 Top 20 pathways of KEGG enrichment analysis in the prevention and treatment of psychological stress asthma with Xiaochuanning Granule KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; TNF: tumor necrosis factor; HIF: hypoxia-inducible factor; NOD: nucleotide-oligomerization domain； PI3K-Akt: phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B.

3.1 組方法度闡釋

首都國醫名師武維屏教授認為支氣管哮喘發作的基本病機在于風盛正虛、氣逆痰阻，而致肝肺失調，因此創制哮喘寧顆粒作為調肝理肺治療哮喘的代表方劑，崔紅生教授帶領團隊守正創新，將之運用于心理應激哮喘的相關研究[20]。該疾病由情志因素誘發或加重，是肝氣失疏泄、情志欠調暢的表現，與肝聯系更加密切，應當以調肝理肺法治之[21]。哮喘寧顆粒謹遵此法，由四逆散、小柴胡湯等經典名方加減化裁而成。柴胡、白芍、枳殼、炙甘草為四逆散易枳實為枳殼，《醫方集解》言之“甘草調逆氣，柴胡散陽邪，芍藥收元陰”，易為枳殼取其氣緩之意，降氣消痰，相合為用，疏肝解郁調和肝脾；且柴胡、黃芩、清半夏取小柴胡之意，和解少陽，調和樞機；葶藶子治痰壅喘咳，麻黃主宣肺平喘；黃芩、半夏、前胡合以清熱化痰降氣；地龍咸寒，寧肝熄風，解痙平喘；益以丹參清熱涼血，活血祛瘀，蕩滌肺中瘀熱。全方和解樞機，清熱化痰，降氣平喘，共奏調肝理肺、止哮平喘之功。

3.2 作用網絡概覽

通過分析可知：哮喘寧顆粒治療心理應激哮喘的有效成分包括蓽澄茄素、異鼠李素、茵陳黃酮、丁子香萜、β-谷甾醇、谷甾醇、山奈酚、兒茶素、柚皮素、川陳皮素、槲皮素等。支氣管哮喘是集氣道炎性反應、氣道高反應[22]、氣道重構于一體的慢性疾病，上述化學成分具有抑制氣道炎性反應、調節氣道過敏反應、改善氣道重構狀況的作用，尤其在抑制氣道炎性反應方面作用明顯。研究[23]表明，蓽澄茄素可保護神經，減輕炎性反應，是調節NEI網絡的潛在成分；藥理實驗發現槲皮素與山奈酚可有效治療咳嗽，改善動物模型行為學表現，是治療哮喘和慢性支氣管炎的主要成分[24]。既往網藥研究[25]也證實槲皮素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇、谷甾醇是哮喘抑制免疫炎性反應的有效化合物。

根據交集基因PPI網絡得到的關鍵靶點對于此病治療具有代表性。譬如絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1, MAPK1)、MAPK8、表皮生長因子 (epidermal growth factor, EGF)主要與增生有關：MAPK一般參與細胞有絲分裂(本研究的GO分析生物學過程也富集得到MAPK通路)，即調節細胞生長、分化、炎性反應[26]等多種細胞過程的三級激酶模式；在壓力環境中，應激反應可激活MAPK核心通路，通過RAS超家族GTP酶作為信號轉導通路的上游激活因子，激活ERK通路，從而促進細胞增生，誘發上皮-間質轉化，促成氣道重塑[21]；EGF可促使氣道平滑肌細胞增生，加劇氣道重塑[22]；啟發后期研究可通過調節這些靶點從而抑制氣道上皮增生、氣道重塑。TNF、IL-6、IL-1β等與炎性反應密切相關[27]，藥物通過這些靶點抑制炎性反應。另外關鍵靶點還有血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGFA)、前列腺素G/H合酶2 (prostaglandin G/H synthase 2,PTGS2)等。

3.3 潛在機制解析

GO與KEGG富集分析結果顯示，哮喘寧顆粒較多基因靶點富集在與神經機制、免疫炎性反應、細胞增生等相關的生物學過程、細胞組分、信號通路與疾病。此即表明哮喘寧顆粒可能通過相關靶基因來調節所對應信號通路，從而調控免疫，抑制炎性反應，發揮防治心理應激哮喘的作用。

神經機制方面，GO富集所得細胞組分有突觸、不對稱突觸、突觸后膜、軸突末端等神經系統解剖結構，生物學過程有信號轉導等，分子功能涵蓋配體激活的的序列特異性DNA結合、轉錄因子結合等，KEGG富集可知信號通路涉及神經活性配體-受體相互作用通路、HIF-1信號通路等。哮喘中刺激物敏感性增加和氣道反應性增強的關鍵機制在于氣道神經重構，與富集結果相符[28]。最近有實驗表明[29]大鼠哮喘模型予霧化吸入抗神經生長因子可通過調節TGF-β/Smad通路抑制氣道重塑。既往網藥研究[30]也表明哮喘與神經活性配體-受體相互作用途徑高度相關，可通過該通路中的關鍵蛋白β-2腎上腺素能受體調節cAMP從而導致氣道平滑肌松弛，屬于β受體激動劑的分子靶標；也可通過組胺H4受體影響卵清蛋白誘導的小鼠哮喘模型肺組織和氣道中嗜酸性粒細胞之浸潤以干預炎性反應[30]。嚴重哮喘發作以缺氧為特征，通過特定的轉錄因子HIF-1(由HIF-1α和-1β亞基組成的異二聚體)調節，HIF-1α缺乏會導致Th17細胞減少，但會增強Treg細胞的分化并保護模型小鼠免于自身免疫性神經炎性反應的侵襲[31]。有研究者[32]在Science發文指出肺神經內分泌細胞(pulmonary neuroendocrine cells, PNEC)作為特殊的氣道上皮細胞，可放大過敏性哮喘反應：PNEC缺失的小鼠過敏性哮喘模型，能夠減少杯狀細胞增生，致使2型免疫反應明顯減弱，從而提出PNEC通過分泌神經肽與神經遞質發揮作用，與2型固有淋巴細胞共同構成神經免疫模塊對氣道刺激做出應答。

免疫炎性反應方面，GO富集得到樹突細胞質、分泌顆粒等與“免疫-內分泌”有關的細胞組分，KEGG富集得到TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、鈣離子信號通路、T細胞受體信號通路等與免疫炎性反應密切相關[33]，其間存在多重交互作用。①TNF信號通路介導機體炎性反應、細胞免疫等病理過程，通過負反饋調節Th2細胞的功能，在哮喘治療中發揮潛在作用。心理因素如抑郁癥狀相關的IL-1β(本研究基于cytohubba得出)和TNF-α的釋放與哮喘氣道炎性反應相關，作為哮喘神經心理表型的靶向生物標志物[34]，與心理應激哮喘相聯系。另有研究[35]證實TNF-α誘導的蛋白3是兒童哮喘加重的關鍵因素。②NOD樣受體信號通路的激活促支氣管哮喘加重[36]。NOD樣受體蛋白3的抑制與細胞凋亡的消失有關，嗜酸性哮喘小鼠模型中可抑制Th2反應，并減少肺泡細胞的凋亡[37]。③Toll樣受體信號通路與機體的免疫性反應密切相關， TLRs是模式識別受體，在病原體的檢測、反應中起關鍵作用，表達于固有免疫和獲得性免疫的各種細胞，參與識別病原微生物、調控機體免疫應答等反應。有研究[38]表明TLR4、TLR5[39]、TLR7[40]與成人哮喘有關，可誘導各種促炎性反應因子產生，肥大細胞增加；其中，TLR7激動劑在過敏性哮喘患者中已被證明可上調Th1反應，下調Th2對過敏原的反應[40]。④鈣離子信號通路可能與哮喘氣道高反應性有關，而氣道炎性反應正是氣道高反應重要機制之一，通過調節G蛋白偶聯受體信號傳導促使氣道高反應[41]，應用鈣離子通道阻滯劑可促進哮喘患者肺功能的改善[42]。⑤HIF-1信號通路中，HIF-1α參與哮喘炎性反應的過敏反應[31]。⑥T細胞受體信號通路中Th1/Th2[43]以及Th17/Treg[44]細胞因子之間失衡是哮喘主要病理機制，上述通路均通過作用于此通路調控哮喘表型，故不作贅述。

細胞增生方面，GO富集得到細胞增生正調控、MAPK通路激活(3.2已討論)等生物學過程，涉及酶結合、轉錄因子結合等分子功能，KEGG富集得到PI3K-Akt信號通路在細胞的增生、分化、凋亡等方面有著重要作用。激活PI3K使Akt磷酸化，然后活化mTOR及其下游蛋白，實現對細胞生長、增生、凋亡的調節。既往研究[45]表明抑制PI3K信號轉導，能夠恢復Th17/Treg平衡，而Th17/Treg細胞平衡對于防治哮喘起重要作用，高水平Treg細胞能夠抑制氣道平滑肌的過度增生以及氣道上皮組織纖維化，從而延緩氣道重塑，從而預防哮喘發病。其中，PI3K-Akt-mTOR信號通路對于氣道平滑肌的生長、增生過程很重要，用雷帕霉素阻斷mTOR可抑制哮喘氣道重塑[46]。

本研究創新之處在于重視中醫情志因素對發病的作用，針對哮喘的新表型——心理應激哮喘，運用網絡藥理學方法探討臨床行之有效的哮喘寧顆粒所構成的作用網絡，闡發其潛在機制。不足之處在于目前尚未驗證網藥結果所揭示的相關機制，擬在未來研究中進行實驗驗證。

綜上所述，心理應激哮喘是由大腦對應激形成神經反射，通過NEI網絡增強Th2型免疫炎性反應，造成發病或加重。哮喘寧顆粒防治心理應激哮喘屬于多類組分、多種通路、多重靶點交互作用的復合機制。該藥可能通過多種有效成分作用于MAPK1、MAPK8、TNF、VEGFA、EGF等靶點，調節神經活性配體受體相互作用、TNF、NOD樣受體、Toll樣受體、鈣離子、T細胞受體、PI3K-Akt等信號通路，作用于神經機制、免疫炎性反應、細胞增生等方面，以綜合調節NEI網絡，緩解應激反應，抑制氣道炎性反應，延緩氣道重塑，從而為深入研究該方防治心理應激哮喘的機制提供思路與依據。